时间：2023-10-17 09:36:10
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关键词：事实劳动关系；法律风险；防范措施
一、事实劳动关系的内涵及产生原因
（一）事实劳动关系的内涵。所谓劳动关系，是指劳动者与劳动力使用者（用人单位）之间在劳动生产过程中建立或结成的关系。劳动关系具有以下特征：当事人一方是劳动者，另一方必须是提供生产资料的用人单位；劳动者必须是基于职业的、为实现用人单位的劳动过程而进行有偿的劳动；劳动者必须成为用人单位的成员，并遵守单位的内部劳动规则，主体双方具有平等性和隶属性。
事实劳动关系是用人单位与劳动者之间既无劳动合同又存在着劳动关系的一种状态。事实劳动关系区别于劳动关系只因其缺乏法律所规定的形式要件―书面劳动合同，但其本质上属于劳动关系。是否成立事实劳动关系可依据其是否具有劳动关系的特征来判断。
（二）事实劳动关系产生的原因。实践中，事实劳动关系大量存在，但究其产生的原因主要集中在以下两点：其一，自劳动关系建立之时起，从未订立书面劳动合同。依据《中华人民共和国劳动合同法》（以下简称《劳动合同法》）第十条： “建立劳动关系，应当订立书面劳动合同。已建立劳动关系，未同时订立书面劳动合同的，应当自用工之日起一个月内订立书面劳动合同。用人单位与劳动者在用工前订立劳动合同的，劳动关系自用工之日起建立。”可见，引起劳动关系产生的基本法律事实是用工，而不是订立劳动合同，其目的保护事实劳动关系中劳动者的权益，而非肯定用人单位不与劳动者订立劳动合同的行为。在就业竞争激烈，劳动力供大于求的情况下，不签劳动合同用人单位便拥有更多的灵活性，是否签订劳动合同的主动权往往掌握在用人单位手中。我国劳动法对劳动者的倾斜保护的立法宗旨，要求建立劳动关系应当订立书面劳动合同的规定，使一些人错误地认为：订立了劳动合同劳动者就受劳动法的保护，未订立劳动合同的劳动法不给予保护。用人单位为逃避相关法律法规的强制性义务如缴纳社会保险等不与劳动者签书面劳动合同。现实中，不签订劳动合同也可能是劳动者认为有了书面劳动合同会约束自己不能随意“跳槽”，主动要求不签或者故意拖延不签而用人单位没有及时作出处理。再或者是双方法律意识淡薄，根本没有意识到建立劳动关系必须签订书面劳动合同，达成了不签劳动合同的合意。其二，原劳动合同期满后，当事人未续订新的劳动合同，但劳动者仍在该单位继续劳动。人力资源管理实践中，当原有劳动合同即将期满时，用人单位应以明示的方式通知劳动者，否则，很容易造成新劳动合同未签，原劳动合同已期满，劳动者仍然在用人单位继续工作，劳动关系以原劳动合同相关约定存续着。此种情况下，虽然看似双方默示约定，但用人单位往往会很被动，甚至承担意料之外的法律风险。
二、事实劳动关系中用人单位面临的法律风险
（1）用人单位新聘用员工，不依法签订书面劳动合同的，将面临支付“双倍工资”的风险。依据《劳动合同法》及相关实施条例规定，用人单位与劳动者应当自用工之日起一个月内订立书面劳动合同，超过一个月不满一年未与劳动者订立书面劳动合同的，应当向劳动者每月支付两倍的工资。（2）若用人单位与劳动者之间的事实劳动关系超过一年的，默认为双方之间成立了无固定期限劳动合同。依据《劳动合同法》及相关实施条例规定，用人单位自用工之日满一年未与劳动者订立书面劳动合同的，自用工之日起满一年的当日视为已经与劳动者订立了无固定期限劳动合同，并应当立即与劳动者补订书面劳动合同。用人单位不签书面劳动合同往往是希望逃避法律义务，有更灵活的用人权，而从法律的规定可见，不与劳动者签订劳动合同，用人单位不仅获得不了灵活的用人权，还会得不偿失，一旦成立无固定期限，用人权将会受到极大限制，劳动者获得的将是类似于“铁饭碗”的稳定工作，只有符合法定解除劳动合同情形，用人单位才能解聘劳动者。（3）对于劳动合同到期后没有续签而劳动用工关系仍然存续的，劳动者除了可能获得双倍工资、无固定期限劳动合同外，还可能获得解除劳动合同的经济补偿金。（4）缺乏书面劳动合同，用人单位将面临无法有效约束劳动者“诚信义务”的法律风险。根据劳动法律的规定，劳动者有“诚实履约”、“忠于本职”、“保守商业秘密”和“竞业禁止”等诚信义务。在事实劳动关系中，因双方之间没有签订书面劳动合同，往往无法将这些义务的内容和违约责任具体化、明确化，达到有效约束员工行为，保障用人单位利益的目的。
综上，在《劳动合同法》颁布实施后，其系列法律法规加重了用人单位在事实劳动关系中的法律责任和违法成本。因此，用人单位明智之举应该是依法行事，及时与劳动者建立劳动关系，有效规避事实劳动关系带来的法律风险。
三、防范因事实劳动关系引发劳资纠纷的建议
（1）作为国家管理层面，一方面要从立法上不断完善对事实劳动关系的 保护；另一方面，劳动行政主管部门和司法部门，对事实劳动关系案件，用人单位有过错的，及时查处，及时审理，及时处罚。（2）作为用人单位，上至单位领导者，下至人力资源管理人员，思想观念要正确，要知法守法、依法行事，不可存逃避法律义务的侥幸心理。（3）用人单位要建立健全劳动关系管理制度。具体体现在：其一，用人单位与劳动者建立劳动关系应当及时订立书面劳动合同，劳动者拒不签订劳动合同的，应当及时采取相关措施或通知劳动者解除双方劳动关系，针对特殊岗位的员工，用人单位应建立特殊的管理制度，并及时有效的执行，才能降低企业劳动人事法律风险的发生。其二，要强化招聘流程的科学性。很多单位在员工招聘中出于考察拟聘劳动者能力、用工节约成本等目的，往往采取“先上岗试用，后签约转正”的方式，从而增加了产生事实劳动关系的风险。解决途径就是要改变传统招聘流程，做到“先签约，后上岗”，以避免超过法定签约期，支付“双倍工资”的风险。如果劳动者处于个人目的，故意拖延不签订劳动合同的，应该及时书面通知劳动者终止劳动关系。其三，健全工作制度，做到合同档案管理规范化。员工劳动合同实行科学规范、动态管理，专人负责，及时审查，未签的及时补签，劳动合同即将期满该续签的续签，该终止的提前书面通知。其四，相关责任人要实行问责制。一旦因为部门或具体负责人员故意或失误造成不签、漏签劳动合同，给单位造成相应损失的，应追究相关人员的责任。（4）作为劳动者，要有强烈的权利意识。当合法权益受到侵害时，劳动者要勇于用法律武器维护自身权益；但是，劳动者也不可目光短浅，满足于眼前利益，恶意用法，故意不签劳动合同。另外，事实劳动关系往往举证困难，作为弱势群体，劳动者要注意相关证据的留存。
总而言之，用人单位劳动用工法律风险是其在招聘及用人过程中存在的重要风险之一，在目前《劳动合同法》、《工资支付条例》的立法总体重于保护劳动者利益的环境下，用人单位应当重视和理解包括《劳动合同法》在内的法律法规，不断提高防控劳动用工法律风险的能力，促进劳资双方共同和谐发展，实现互利共赢。
参考文献：
关键词：合同管理；法律风险；防范措施
建设工程合同通常是发包方和承包方进行工程承发包的重要法律形式，是进行工程施工、监理和竣工验收的主要法律依据。建设工程合同的订立到最终的履行,对合同双方的根本利益都有直接的影响。合同一旦订立，就确立了当事人双方对工程项目的管理责任和双方的经济法律关系，也是双方实施工程管理，享有权利和承担义务的法律依据。合法、有效的合同，更让会当事人认真履行，同时还可以有效地预防纠纷的发生。一旦发生纠纷，当事人也可以请求仲裁机构或人民法院依据合同条款保护其合法权益。合同风险是指在合同实施中环境、组织、技术、管理、业主信誉等情况发生变化导致承包商经营失利而遭受的损失。合同条款中潜伏的风险通常表现为责任不清、权利不明所致。认真分析研究合同实施过程中的各种风险因素，在签订工程承包合同时尽量避免承担风险的条款，最终采取有效地措施，都可以有效地防范工程承包中法律风险的发生。
1 合同里存在的法律风险
1．1合同主体不合格的主体，必须要是具有相应的民事权利能力和民事行为能力的合同当事人。合同主体不合格通常包括两种情况，一种是虽然具有上述两种能力，但不是合同当事人，即当事人错位，当然是不合格的合同主体。另一种是虽然是合同当事人，可是没有上面的两种能力，同样是不合格的合同主体。合同的主体就是工程的发包方和承包方，合同主体不当之处主要表现在：工程发包方和承包方缺乏合同履约意识，既不认真研究制订合同条款，又不严格履行合同。在合同履约过程中由于缺少制约手段，违约情况比较严重，导致合同双方当事人的合法权益得不到应有的保护，工程进度、工程质量也难以得到有效的保证。
1．2合同条款不平等工程承包原则上应以合同为约束依据，而合同的重要原则之一就是平等性。可是在工程承包实践中，业主与承包商往往没有平等可言。经过对当前的工程承包买方市场的特点的分析，少数业主往往会借助僧多粥少这一有利的优势，对承包商蛮不讲理，尤其是政府投资工程项目的业主部门。在签订承包合同时，业主通常会强加各种不平等条款，赋予业主各种不应有的权力，而对承包商则只强调应履行的义务，不提其应享有的权利。例如索赔条款本来是合同的主要内容，可是在多数合同中却闭口不提；又如误期罚款条款，基本上所有合同中都有详细规定，而且罚的制度极严。承包商如果在拟定合同条款时不坚持合理要求，就会给自己留下很大的隐患。
合同文字不严谨就是不准确，较容易引发歧义和误解，致使合同难以履行或引发争议。依法订立的有效合同，必须真实的反映合同双方的意愿。而这种反映只有靠准确、明晰的文字来体现。可以说，合同讲究咬文嚼字。但有些合同由于一些人为的或客观的原因，对一些合同条款拿捏不准或措辞含混不清。还有些合同对承包商的义务规定得非常具体，而对其应享有的权利则笼统地一笔带过，甚至对有些关键事项含糊其词。比如有些工程承包合同中在有关追加款额的条款中写道：“发生重大设计变更可增加款额”这类字句。那么，何为重大设计变更则并无细则说明。如果发生类似情况，业主或监理工程师往往便会视情随意曲解。
合同内容不完备甚至有的使用境外文本。因为国情不同、语言文字不同，加上翻译问题，使得这些合同文本存在很多疑问。特别是发展中国家的合同，因为这些国家过分强调独立自创，往往不愿意沿用国际上普遍遵循的条款，而他们自己制定的一些法规或合同条例一般都不完善，遗漏事项颇多。导致在合同履约过程中，承包商经常找不到合法依据来保护自己的利益。
合同管理不到位，少数合同管理人员的业务素质很低，对工程承包合同风险防范意识不强，致使在合同履约过程中遭受到一些本可避免的损失。有的没有及时发出应当发出的文件，给以后索赔造成困难。有的对合同签证确认不重视，对应签证确认的没有办理签证确认，当发生纠纷时，因无法举证而败诉。有的对拖欠工程款的情况应当追究的没有及时追究，当诉诸法律时才发现已超过了诉讼时效，致使损失无法挽回。有的对发包方不按合同约定支付工程进度款，一味地怕单方面停工承担违约责任而不敢行使抗辩权，结果客观上造成了垫资施工，使发包方的欠款数额越来越大，问题更加难以解决。
2 预防法律风险的主要对策
2．1 建立健全合同管理的组织网络，做到建设工程合同管理专业化、正规化，使建筑企业合同管理覆盖企业的每个层次，延伸到各个角落。制订本企业的合同管理制度，检查监督本企业各类建设工程合同的订立、履行是建筑企业内部合同管理机构的主要职责；它的职责还有：宣传贯彻有关合同法律、法规培训合同管理人员；审查合同，防止利用合同进行违法活动；参与解决合同纠纷；总结推广合同管理经验等等。合同管理人员的组成必须以法律顾问为核心，成员主要是企业的管理人员和购销人员。要在企业负责人领导下开展工作，还要接受负责管理合同的国家有关行政主管部门的指导监督。
2．2 建立健全合同管理的制度网络制度网络，首先是指企业就合同管理过程中的每个环节，建立和健全具体的、可操作的规章制度，使合同管理有章可循。其次是指建筑企业各层次都应有自己的合同管理制度。合同管理制度是合同管理活动及其运行过程的行为规范。合同管理能否成功的关键在于合同管理制度是否健全。制订合同管理制度，是搞好建筑企业合同管理的重要保证。这些合同管理制度主要包括：合同归口管理制度；合同审查制度；委托制度；合同考核制度；合同用章管理制度；合同台帐、统计及归档制度。与此同时，还必须把这些合同管理制度与建设工程合同投标报价、工程项目管理的全过程有机结合起来，贯穿于整个工程项目建设的始终。
1 发病症状
茄子苗期、成株期都可发病。叶、茎、花、果实均可受害,但主要危害果实。幼苗染病,茎基部或中部初现暗褐色水渍状病斑,病情发展快,常腐烂,继而幼茎变软缢缩,致幼苗猝倒样死亡。叶片发病,初期产生褐绿色不规则形或近圆形水渍状较大的病斑,后渐变为暗褐色,并在病部上可见较明显的轮纹。湿度高时病斑上可见稀疏白霉长出,但病健界处不明显,只有在气候干燥时病斑边缘才明显,无白霉长出,并易干枯破裂。茎秆受害,初呈褐绿色或紫褐色水渍状病斑,后茎秆渐渐缢缩软化而折倒,致使病部以上枝叶垂萎至死亡,潮湿时病部可见着生的稀疏白霉。花器受害,多表现褐色腐烂,并向茎部蔓延危害。近地面的茄果易先发病,在茄果表皮初显褐黄色至褐黑色近圆形水渍状斑点,病部略凹陷、软腐并带有皱褶,病缘不明显。随后病斑蔓延迅速,造成整个茄果被侵染危害,茄果肉呈淡褐色腐烂状,气候潮湿时茄果病处着生大量白色棉絮状浓密霉层,并能使全茄果都长满,但干燥时只见少而稀疏霉或无霉。病茄果易脱落在地上,在潮湿地面上病情会继续发展,很快造成茄果上长满白霉、腐烂;在干燥地上病茄果会逐渐腐烂失水,干缩变成褐黑色僵果。
2 病原形态
引起茄子绵疫病的病原菌有多个,均属于鞭毛菌门真菌。常见的病菌是寄生疫霉(Phytophthora parasitica Dast.)和辣椒疫霉(P. capsici Leon.)。菌丝白色棉絮状,分枝多,无隔,气生菌丝发达。孢囊梗无色纤细,分枝极少,无隔膜。孢子囊无色或稍黄,球形、卵圆形或长卵圆形,大小为 20~50 μm × 30~70 μm;孢子囊顶端明显有状突起,大小为5.8 μm×6.2 μm。菌丝顶端或中间会有大量黄色圆球形厚垣孢子产生,直径 20~40 μm,壁厚 1.3~2.5 μm,单生或串生。
3 发病规律
3.1 侵染循环途径
病菌的卵孢子经安全越冬后,在来年的茄子生长期,通过雨水溅击或灌水传播到近地面的茄株、茄叶或茄果上,从表皮直接侵入或伤口处侵入,进而侵染危害茄子。病斑上产生的游动孢子借助风雨或水流进行再传播侵染危害,周而复始,扩大侵染流行。秋后在病组织中形成卵孢子随病残体组织在土中越冬。
3.2 发病气候条件
该病的发生适应温度范围很广,在8~40 ℃ 均可。最适宜病菌的发育、流行的气候条件是温度在25~35 ℃、相对湿度85% 以上。实践中,在茄子整个生长结果期间,气温较易满足病菌生长流行的需求,因此影响该病发生早晚、轻重、流行的决定性因素主要是湿度。在适宜的气候条件下,病菌经1~3 d繁殖即可再侵染茄果。在夏季雨季,田间的湿度大,特别是时晴时雨的梅雨天或高温闷热天气,以及暴风雨后突然放晴有利于该病的发生与流行。一般在大雨后的2~3 d,茄子绵疫病往往呈现田间发病流行高峰。各年度间发病程度存在较大差异,发病重且早、损失大的年份往往是雨季出现早、雨日与雨量均多。各地发病时间也因气候不同有明显差别,南方地区常在5—6月的梅雨季节及8—9月发生流行,所以春茄子易遭受严重危害;北方地区则在7—8月的雨季时易发生流行。
3.3 栽培技术影响
在设施栽培生产中,由于大棚塑料薄膜滴水或破损漏雨而引起发病。另外,土质黏重、连茬种植、管理粗放、地势低洼、地下水位高、雨后积水、排水不良、过度密植、偏施氮肥、杂草丛生的地块和连续阴雨的年份发病较重。植株生长郁闭、嫩绿,田间通风透光性不良,也有利于病害发生。
4 防控技术
4.1 选用适宜的抗病品种
种植抗病或耐病品种是预防茄子绵疫病发生流行的重要措施之一。抗病性在茄子品种间有明显差异,圆茄种类一般比长茄种类有抗性,厚皮种类一般比薄皮种类有抗性,早熟种类一般比晚熟种类有抗性。抗病或耐病性较好的品种有‘布利塔茄’、‘湘茄4号’、‘宁茄8号’、‘兴城紫圆茄’、‘长野狼茄’、‘北京九叶茄’、‘辽茄3号’、‘黑骠茄’等。
4.2 壮苗定植
有条件的地方可采用有机基质穴盘育苗,培育的秧苗不仅根系发达,抗病性强,并能避免苗床、育苗营养土带菌问题,减少病菌侵染机率。定植时坚持选用健壮茄苗,不用病残茄苗,移栽时尽量带土少伤根,不给病菌侵染的机会。茄苗健壮标准:茄株高度17~20 cm,茎秆粗度0.8~1 cm,节间长1.3~1.5 cm,真叶有7~8片,叶片深绿色且大而厚,叶间展开度大于株高,生有即将开放的大花蕾,根系呈白色。
4.3 实行换茬轮作
与非茄科作物如十字花科、豆科、葫芦科等实行2年以上轮作,忌重茬。秋冬深翻土层进行冷冻晒垡。选择地势较高、排灌方便、沙质壤土地块种植。土地要平整,雨季注意及时排水,做到雨后无积水。
4.4 提倡地膜覆盖栽培及合理密植
覆盖地膜可有效阻止土中病菌飞溅传播到茄子上,并利用日光增温进行高温灭菌及控杂草生长。依各地自然条件,可选用深沟窄高畦或半高畦栽培方式,沟渠一定要保持通畅,便于田间排水降湿。茄子种植密度要适宜,株行距一般为50 cm × 60 cm,每667 m2种植 2 200~2 500株。种植太密,田间通透性不良,茄株生长软弱,易感病。
4.5 加强田间管理
基肥中农家肥必须经充分腐熟后再施用,磷钾肥应适当增施,追肥要及时。水分管理切忌大水漫灌,在茄子定植时应浇足穴水,蹲苗时适当控水,缓棵后浇水要湿干相见,有利提高植株抗病力。可采用滴灌等灌溉方式,降低病菌随灌溉水传播。为防止茄株侧倒触及地面,可插竹竿绑定茄株,及时摘除茄株下部老叶,门茄坐果后适时打掉门茄以下侧枝,改善田间通风透光条件,有利于降低田间相对湿度,促进植株健壮生长。刚发病时要随时去除病叶或病果,清洁田园的残株落叶,将病残体携带出田外集中深埋或烧毁,以防病菌再次传播侵染。
关键词：氯噻啉 多克隆抗体 时间分辨免疫分析
中图分类号：S482 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）24-0000-00
氯噻啉（imidaclothiz）是我国公司自主研发一种新烟碱类杀虫剂，与常规杀虫剂没有交互抗性，因而可用于抗性治理，广泛应用于那些对有机磷类、氨基甲酸酯类、除虫菊酯类已产生抗性的农林业害虫的防治[1]。由于其具有高效、广谱、低毒等优点，氯噻啉使用量日益上升，不合理的使用也经常出现，对环境造成很大压力，因此，研制快速廉价、灵敏度高、稳定性好和筛通量大的检测氯噻啉残留的常规方法，加强对氯噻啉药物的检测和控制是一项刻不容缓的工作。
目前，有关氯噻啉残留检测方法主要是高效液相色谱法（HPLC）[2-4]。但前处理过程比较繁琐，检测结果受样品净化、浓缩等步骤的影响，不适合进行批量样品的快速检测。而免疫分析技术具有很高的精确度、更灵敏的反应，更强的特异性、不高的技术要求、更短的检测时间和大批量测定等优点，越来越受到人们的重视。抗氯噻啉农药的多克隆抗体的酶联免疫分析技术（ELISA）也有报道[5]，然而该方法检测灵敏度不太理想。时间分辨免疫分析技术具有高灵敏性、高选择性、快速等优点，可以弥补普通ELISA免疫分析技术灵敏度的不足。本研究建立了氯噻啉的TRFIA残留检测方法，为环境与食品中痕量氯噻啉残留高灵敏检测提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
96孔聚苯乙烯荧光板（江苏省原子医学研究所）；95%氯噻啉原药（南通江山农药化工股份有限公司）；卵清蛋白（OVA）、正三丁胺、氯甲酸异丁酯（Sigma公司）；Eu3+标记盒为PerkinElmer公司产品；荧光增强液，（江苏省原子医学研究所）；碳酸盐缓冲液（CBS）：0.05M，pH 9.6；磷酸盐缓冲液（PBS）：0.01M，pH 7.4；氯噻啉多克隆抗体为本实验自行制备；二甲亚砜（DMSO）、N，N-二甲基甲酰胺、磷酸二氢钾、氢氧化钾等试剂均为分析纯。
1.2包被原的合成
氯噻啉的半抗原合成参照文献[5]，将合成的半抗原与卵清蛋白（OVA）偶联通过混合酸酐法制备包被抗原。反应液用PBS在4℃下透析3天。根据三者在280 nm的摩尔吸光系数（ε）估算半抗原与载体蛋白的偶联比[10]：结合比=（ε偶联物-ε载体蛋白）/ε半抗原。
1.3 包被板的制备
包被抗原用0.05 M pH 9.6 CBS溶液稀释至5 μg /mL，加入到96孔微孔板中（100 μL /孔），4℃包被过夜，弃去包被液，加入封闭液，每孔200μL，37 ℃孵育2h，弃去封闭液，真空抽干，-20℃冷冻保存。
1.4 Eu3 + 标记抗体的制备
取适量的PBS溶解的抗氯噻啉的抗体，在4℃下碳酸盐缓冲液（0.05 M，PH 8.5）透析2次，每次24h，目的是除去溶液中NaN3并且转换成碳酸盐缓冲液。在碳酸盐缓冲液环境中用DTTA-Eu3+标记抗体。取0.5 mg上述透析的抗氯噻啉的抗体加入含0.2 mg 的DTTA- Eu3+的小瓶中，室温下磁力搅拌反应24 h。将Eu3 +标记抗体溶液加入到Sephadex G-50层析柱中，用含0.9% NaCl的Tris-HCl洗脱液洗脱。收集层析柱流出液（ 1mL/管），逐管测量其吸光值（A280 nm），合并峰管。以Eu3+标记试剂盒说明书提供的方法测定并计算抗体标记率。
1.5 回收率的测定
河水经过滤，添加不同浓度（0.05-0.5 mg/L）的氯噻啉标样，用含甲醇的PBS稀释，直接用于TRFIA测定。称取10g土壤，添加不同浓度（0.05-0.5 mg/kg）的氯噻啉标样，静置一段时间，加入40mL二氯甲烷进行超声提取，4000 r/min离心。取上清液20 mL减压浓缩，用含甲醇的PBS定容到10mL。每个处理设3个重复，各设一个空白对照，用建立的TRFIA法对样品进行分析。
1.6 分析测定
取准备好的酶标板，加入50μL的氯噻啉标准品或处理好的样品溶液到酶标孔中，加Eu3 + 标记抗氯噻啉抗体（50 mmol/L pH 7.4的PBS稀释）100μL，室温振荡孵育30 min，用含0. 1% 吐温-20的Tris-HCl（50 mmol /L pH 7.8）洗涤液洗6次。加200μL 增强液，振荡孵育5 min 后，用荧光检测仪进行测定。
2结果与分析
2.1包被原的鉴定
对氯噻啉半抗原、OVA及偶联物进行紫外全波长扫描，发现偶联物的紫外吸收光谱具有载体蛋白和半抗原的紫外吸收特征，说明偶联成功，如图1所示。根据它们在280 nm波长下的摩尔吸光系数估算得到包被原的结合比为8.5：1。
2.2 Eu3 +标记率
Eu3+标记抗体溶液经Sephadex G-50层析，用离心管收集出现的第1洗脱峰，以PerkinElmer公司提供的Eu3+标准为参考，计算得出第1洗脱峰的Eu3+含量为22.4 μmol /L，蛋白质含量为4.7 μmol /L，即平均每个免疫球蛋白分子上标记了4.8个Eu3 +。
2.3标准曲线的建立
各参考标准品浓度以及荧光值建立氯噻啉的标准曲线，曲线方程为Y=-2.292X-3.0874， IC50为0.0447 mg/L，最低检测限为0.005 mg/L。 图2表明本试剂具有良好的剂量-反应线性关系。
2.4 抗体的特异性
用TRFIA在相同的条件下测定氯噻啉和结构类似烟碱类杀虫剂对抗体的交叉反应，计算各自的IC50和交叉反应率CR（表1），结果表明得到的抗体对氯噻啉有较好的特异性，与大部分杀虫剂的几乎没有交叉。
2.5 回收率测定
在河水和土壤中添加不同浓度的的氯噻啉标样，按照TRFIA进行回收率测定，检测结果见表2。在水和土壤中分别添加氯噻啉标准溶液，平均回收率为81.7%～103.8%，变异系数为3.9%～10%，符合农药残留检测要求。
3 讨论
本文基于多克隆抗体建立了氯噻啉TRFIA免疫分析方法。其灵敏度（IC50）较先前报道的ELISA[5]有了很大的提高（大约5倍），方法的抑制中浓度可达到0.0447 mg/L。可见TRFIA法检测氯噻啉比ELISA 法灵敏度上具有明显优势。时间分辨荧光免疫分析具有示踪物稳定、无放射性污染、灵敏度高、操作简便、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰、标记物储存时间长等优点[6-9]，使得试剂标准曲线飘移小，更提高了试剂的稳定性和准确性。在研究抗体标记和发光过程中发现：抗体的浓度与标记效率和本底发光值成反比，高浓度标记抗体，能够提高灵敏度和降低本底，使我们建立方法所需要。本文建立的氯噻啉-TRFIA 法，与方松等人的报道在灵敏度上有了很大的提高，可以用于环境与食品中痕量氯噻啉的检测需求。
参考文献
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一、基层央行依法行政中的问题及隐含的法律风险
（一）法律监督力量薄弱，依法行政工作运行体制不够顺畅。目前县支行的大多数法律事务人员需要承担办公室其他行政管理工作，无法将精力集中于法律事务工作，从而难以发挥法律事务人员在推进依法行政工作中的统筹、协调作用，影响了对依法行政工作的指导和监督水平。
（二）执法人员法律知识欠缺，依法行政的能力和水平较低。
（三）对依法行政法律风险认识不到位。少数县支行的个别部门和员工不能充分认识到依法行政的严肃性，对于什么是依法行政，为什么要依法行政，如何做到依法行政认识模糊。
（四）依法行政流程控制环节衔接不够规范。个别部门少数员工责任意识不强，不能按照人民银行总分行制定的操作流程依法行政，执法过程中凭经验和习惯办事，员工之间相互配合不够默契，衔接不顺畅，导致现场检查个别环节缺失、行政处罚档案资料不全等现象发生。
（五）依法行政监督检查机制不够完善。县支行个别部门负责人对本部门依法行政情况的监督检查存在薄弱环节。依法行政管理部门对执法职能部门执法行为合法合理性监督检查的频度和深度也嫌不足。
（六）依法行政横向信息沟通不够畅通。执法部门负责人、执法人员、法律事务人员之间未能建立有效的信息沟通渠道。个别员工无执法证参加执法活动，执法部门负责人和法律事务人员在进行现场检查立项审批时也未核实检查组成员的执法资格。基层人民银行与地方政府相关部门的工作协调与信息共享沟通联动机制也不够健全。
二、防范基层央行法律风险的措施
基层人民银行要严格按照法律规定的权限和程序开展行政执法工作，确保依法行政工作做到既不能失职不作为，又不能越权乱作为，有效防止依法行政权力失控、决策失误等问题发生。建议：
（一）加强依法行政工作组织领导。人民银行县支行要进一步加强对依法行政工作的组织领导，有关领导小组及领导小组办公室要切实履行职责。
（二）加强行政执法人员队伍建设。基层人民银行要把加强行政执法人员队伍建设作为推进依法行政的一项基础性工作。
（三）增强行政执法人员法制观念。基层人民银行要加大对执法人员职业责任、职业道德、职业纪律和法律风险的教育引导力度，提高执法人员法律风险防范意识。
（四）加强行政执法检查流程控制。基层人民银行要加强宣传教育，使行政执法人员按照人民银行法赋予的权利，依法履行行政检查监督职责，确保依法行政操作流程有效衔接。
关键词：劳动纪律 管理 检查
大庆石化公司炼油厂作为建厂50多年的老厂，作为炼油化工企业，装置连续运转，操作工实行倒班工作制，这对于在岗员工的劳动纪律、工作状态有较高较严的要求。炼油厂多年来在员工管理、员工队伍建设、调动员工工作积极性等诸多方面进行了长期的努力与探索。尤其在员工劳动纪律管理方面，炼油厂历任劳动纪律管理部门进行了许多实践，总结了许多方法，取得了一定的成效，为炼油厂50多年来的持续发展做出了贡献。
随着炼油厂的不断发展，炼油厂员工素质不断提高，工作环境、工艺条件等不断变化，老的劳动纪律管理办法有些已不适应现在的管理要求，对于劳动纪律管理提出了新的挑战。为了更好为炼油厂生产保驾护航，近年来炼油厂不断总结经验，努力在原有管理模式的基础上拓宽思路，探索了几项劳动纪律管理办法，加强炼油厂劳动纪律管理力度，提高员工工作积极性。
一、实行炼油厂总值班检查挂牌制度
炼油厂长期以来都是由人事处一个部门进行劳动纪律管理，受人员、工作性质等限制检查强度、管理力度都不尽如人意。炼油厂生产值班人员按规定在值班期间要求进厂检查2-3次，之前对于生产值班人员检查内容没有明确要求，导致生产值班人员到车间岗位只是走过场、走形式。
为了强化炼油厂劳动纪律管理，提高总值班人员入厂检查质量，炼油厂人事处征得厂领导同意在2009年初制定办法要求总值班进行检查挂牌。前期由炼油厂人事处从全厂各车间了解、征集、汇总操作服务岗位巡检路线，并编制了《炼油厂岗位巡检路线表》，并统一制作“炼油厂总值班巡检牌”。炼油厂要求分厂总值班人员在其值班期间偕同一名调度室当班人员或分厂值班人员进行检查。检查人员到厂调度室领取“炼油厂总值班巡检牌”，参考《炼油厂岗位巡检路线表》随机选择车间、岗位进行检查挂牌（要求：挂牌地点需在岗位员工巡检路线巡检点上，挂牌前后不得通知岗位员工及车间相关人员），检查后返回调度室将挂牌时间、地点等内容填入《炼油厂生产值班巡检表》。车间岗位操作人员巡检发现炼油厂总值班巡检牌后，电话通知炼油厂调度室，并于下班后将总值班巡检牌返还调度室。车间岗位未在规定巡检时间内汇报调度室，视同未进行巡检挂牌，按照炼油厂经济责任制管理规定进行考核。
该制度的实施有效加强了炼油厂劳动纪律管理力度，提高了参加生产值班厂各级领导干部的劳动纪律管理主动性、自觉性，有效提高生产值班人员岗位检查质量。同时通过生产值班检查挂牌制度的实施，有效提高了各车间劳动纪律管理的重视力度，岗位员工巡检的认真程度得到极大提高，极大地提高了岗位员工的巡检质量。
二、实行炼油厂巡检小循环制度
岗位操作工“巡检”是其工作职责的一个重要组成部分，巡检质量的好坏将直接影响到装置的平稳、安全运行。巡检不认真，放过一个安全隐患就有可能导致一起重大的安全生产事故，同样巡检认真及时发现设备缺陷、事故先兆就可以避免一起重大安全生产事故。加强巡检、提高巡检质量，一直是分厂、车间各级管理部门始终坚持、不懈努力的目标。
炼油厂各操作服务岗位原巡检路线根据各装置生产实际情况设有若干个巡检点，视为巡检大循环。岗位操作工往往是沿巡检路线例行公事性质的挂牌，对于各巡检点的巡检内容不注意检查，巡检存在应付了事现象。为强化操作服务岗位巡检管理，炼油厂在2009年7月根据巡检大循环上每一个巡检点周围的若干项巡检内容设置相应的巡检旋转牌（即巡检小循环）。通过各车间上报关键巡检点及所需巡检旋转牌个数，炼油厂人事处统计、汇总后，炼油厂设计并制作统一式样的巡检旋转牌，发放到各车间岗位并指导安装。岗位操作工巡检过程中，到达每个巡检点挂牌后，针对巡检内容进行检查并将该处的巡检旋转牌旋转至当时时间。巡检小循环上的巡检旋转牌时间如与实际所应巡检时间不符，按未巡检或巡检不认真处理。
巡检小循环制度的实施迫使岗位员工巡检时自觉按照要求检查巡检点的每一项内容，有效防止巡检走形式、走过场情况的发生，提高了岗位巡检质量。
三、实行炼油厂机关处室分组循环检查制度
为了强化炼油厂劳动纪律管理，有效加强对基层车间劳动纪律的检查力度，提高机关各部门对全厂劳动纪律管理意识，加深机关各部门间的相互协调配合，维护炼油厂正常生产秩序，炼油厂制定机关处室循环检查制度。炼油厂将厂机关按处室分为10个劳动纪律检查组，每三天一组，每组检查人员不少于两人，每组于每月固定三天中至少深入全厂基层车间、班组、岗位检查劳动纪律一次（检查时间、检查方式自定），每次检查岗位不少于八个，每组由专人将检查结果报人事处。
此项措施实施的好处在于：加强了机关各部门的劳动纪律管理意识，劳动纪律检查频次增加，加大了全厂劳动纪律检查范围与管理力度。此项措施实施的不足在于：需加强各处室人员检查劳动纪律的责任心。
四、各车间管理人员工作时间进出厂登记抽查制度
炼油厂要求全厂各车间建立《管理人员进出厂登记本》，在工作时间车间职能人员因公出厂必须在其上进行登记备查（写明出厂人姓名、出厂时间、原因），因私出厂需与车间主管领导请假并登记。各车间《管理人员进出厂登记本》要求放置于方便拿到的地方，以方便随时登记与检查。炼油厂人事处将不定期在“大庆石化公司厂区门禁管理系统”上查询某一时间段的炼油厂人员进出厂记录，并持此记录到所涉及人员单位与该车间登记本进行核对。车间登记本所登记出厂人员的姓名、时间与“门禁管理系统”中查询记录不一致或未登记，则按违纪处理。
五、车间每月上报劳动纪律自查结果制度
炼油厂多年来劳动纪律管理一直遵循的原则是分厂检查，对于发现的违纪行为在全厂调度会上进行通报，之后分厂考核、车间考核。一直以来，各车间都是被动的进行劳动纪律管理，各车间劳动纪律管理积极性不高，大多遵循“分厂查出问题后车间借机很扣，分厂未查出问题则得过且过，应付了事”。炼油厂长期通过检查逼迫车间加强劳动纪律管理，一直在探索行之有效的方式、方法来提高各车间劳动纪律管理的积极性，但始终未找到好的解决方法。
炼油厂要求各车间加强劳动纪律管理，每月25日前将各自车间劳动纪律检查情况进行整理、汇总，并上报炼油厂人事处。对于不按时上报劳动纪律检查情况，按车间未进行劳动纪律检查处理，有分厂统一进行考核。对于未按时上报劳动纪律检查情况和上报检查无违纪的车间，炼油厂将在下一月的劳动纪律检查中进行重点检查。车间每月上报劳动纪律自查结果制度的实施，旨在督促各车间自觉重视劳动纪律管理，减轻分厂管理压力，提高各车间劳动纪律管理的主动性、积极性。
劳动纪律管理是一项任重而道远的工作，是保证全厂员工队伍稳定、保持员工良好工作状态的必要手段。为了炼油厂的长期发展，人力资源管理者必须不断探索、不断创新好的、行之有效的劳动纪律管理方法，保证企业的安稳长满优运行。
参考文献：
【摘要】 目的 选择理想的非特异性抗原封闭方法以适应基于免疫渗滤法的蛋白芯片制备。方法 以杆状病毒-昆虫表达系统制备的人瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白抗原为例，采用脱脂奶粉、小牛血清、牛血清白蛋白及不同组合等5种方法对非特异性抗原进行封闭，检测其在免疫渗滤实验中对消除非特异性染色的效果，寻找最佳封闭非特异性染色的方法。结果 经过多次重复试验，并以PBS代替血清作空白试验，结果显示，目前常用的先固相然后封闭的几种方法，其封闭效果的稳定性和重复性不佳，且空白对照易出现假阳性；同时发现使用脱脂奶粉做封闭剂封闭后，由于奶粉颗粒易堵塞NC膜的孔径，影响NC膜的渗滤速度；使用小牛血清做封闭剂封闭后，由于NC膜对小牛血清的吸附而产生背景，影响结果判读；而采用20g/L BSA先封闭后固相的方法，在实验中得到满意的结果。结论 先封闭后固相的方法，在免疫渗滤实验中对非特异性抗原封闭的效果理想、结果稳定、重复性好，为一种理想的新的封闭方法。
【关键词】 免疫渗滤法；非特异性染色封闭方法；人瘤病毒16型(HPV16)
ChinaABSTRACT: Objective To select an optimal non-specific antigen blocking method by using immuno-infiltration assay so as to suit protein chip preparation. Methods Human papillomavirus type 16 L1 protein expressed by insect-baculovirus espressin system was incubated with skimmed milk powder， calf serum， bovine serum albumin (BSA) combinations of five kinds of methods to block the non-specific antigen. PBS was used as control. The effect of eliminating non-specific stain was detected by immuno-infiltration assay. Results After repeated tests， the results showed that the stability and repeatability of blocking effects were poor for the fixing up antigen first and then blocking method， and the blank control was prone to false positive. The infiltration rate of NC membrane would be affected by using skimmed milk powder as a blocking agent because the pore of NC membrane was easily plugged by milk powder particles. The use of calf serum as a blocking agent made it very difficult to determine the result because the calf serum absorbed by NC membrane produced the background; however， when 20g/L BSA was used to blocking before fixing up antibody， the results became satisfactory. Conclusion Fixing up antibody after blocking in immuno-infiltration assay showed that the blocking effect against non-specific antigen was satisfactory， stable and repeatable， indicating this method is a novel optimal blocking method compared with others.
KEY WORDS: immuno-infiltration; non-specific staining blocking method; human papillomavirus type 16
免疫渗滤法是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为载体进行快速免疫分析的方法[1]，它实际上属于快速斑点免疫结合分析方法(dot immuneobinding assay， DIBA)中的一种，即免疫斑点渗滤分析(dot immunofiltration assay， DIFA)。该法通常是将抗原/或抗体固定于载体上，抗体/或抗原与膜表面固定的配基进行反应。该法灵敏度高(可达ng水平)，操作简便、快速，不需特殊设备，目前在低密度蛋白芯片技术中应用最多，但其非特异性着色却是困惑应用者的最大问题[2]。本研究以人瘤病毒16型(HPV16)L1VLP为抗原，对消除免疫渗滤法检测相应抗体时的非特异性染色方法进行了探讨，获得了满意的结果。
1 材料与方法
1.1 材料
HPV16L1病毒样颗粒(VLP)、胶体金标记的羊抗人IgG抗体由西安联尔科技有限公司制备；硝酸纤维素膜(NC膜，孔径0.45μm)购自美国Hybond公司；待测血清标本来源于西安交通大学医学院第一附属医院(宫颈癌确诊患者40例，儿童血清10例)；即溶脱脂奶粉为黑龙江纽迪希亚营养制品有限公司产品；牛血清白蛋白(BSA)购自华美生物工程公司；商品化HPV抗体检测试剂盒购自加拿大Fulda Biomedical Inc；Tween 20购自美国Promaga公司；小牛血清购自杭州四季青生物材料工程公司。改良TBE洗涤液：Tris Base 54g、硼酸27.5g溶于500mL双蒸水中，加0.5mol/L EDTA-Na2 20mL，调至pH8.0，补双蒸水定容1000mL，加200mL 300g/L饱和硫酸铵[(NH4)2SO4]及40mL Tween 20和双蒸水480mL，充分混匀后使用。
1.2 蛋白定量
双缩脲法测定HPV抗原浓度，用生理盐水调整蛋白浓度为1g/L。将抗原分成两份，一份备用，一份直接应用微矩阵点样机。将HPV16抗原点样于NC膜上，以人IgG(2g/L)为阳性质控点，点间距为3mm，点样量为100mL，并作定位标记，自然风干待检 。
1.3 非特异性染色的封闭[3-5]
方法一：取抗原膜100份，浸入10g/L BSA＋0.5g/L Tween 20中，室温振摇封闭2h，取出50份室温风干；另外50份继续封闭4h后室温风干，待检。方法二：取抗原膜100份，浸入50g/L脱脂奶粉中，室温振摇封闭2h；取出50份，PBS漂洗2min，室温风干；4h后取另外50份，PBS漂洗2min，室温风干，待检。方法三：取抗原膜100份，浸入50g/L BSA＋10g/L脱脂奶粉中，室温振摇封闭2h；取出50份，PBS漂洗2min，室温风干；4h后取另外50份，PBS漂洗2min，室温风干，待检。方法四：取抗原膜100份，浸入100mL小牛血清中，37℃封闭2h；取出50份室温风干，另外50份直接进行免疫渗滤检测。方法五：取 HPV16L1VLP(1mg/mL)50μL与等体积20g/L BSA混合，4℃过夜，按上述点样方法点样，待检。
1.4 免疫渗滤实验
参照文献[6-7]将干燥的抗原膜片(点样面朝上)装入塑料渗滤夹具中，在待检膜下衬垫吸水材料，压紧渗滤夹，依次加洗涤液2滴，血清标本50μL，洗涤液2滴，适度稀释的胶体金标记羊抗人IgG抗体2滴。每步间隔时间为所加试剂完全渗入后再进行下一步。最后加洗涤液2滴，洗去未结合的胶体金。以PBS代替血清作空白对照。结果观察：在膜中央出现红色斑点者为阳性，颜色稍浅者为弱阳性，否则为阴性。其下方的质控对照点为实验有效的标志，无论阳性或阴性结果，对照线均应显示红色。
2 结 果
以脱脂奶粉、BSA、Tween 20及小牛血清为封闭剂，以不同方法进行封闭，检测50例相同的血清标本，每种封闭方法重复试验5次，并以PBS代替血清作空白试验。结果显示，前4种先固相后封闭的方法，其结果的稳定性和重复性受到封闭温度、时间及封闭剂浓度等因素变化的影响，且空白对照易出现假阳性；第2种和第3种加入脱脂奶粉的封闭方法，封闭后由于奶粉颗粒易堵塞NC膜的微孔，影响渗滤速度；小牛血清做封闭剂则由于NC膜对小牛血清的非特异吸附而产生背景，影响结果判读。而采用20g/L BSA先与抗原共育后再点膜的方法，其封闭效果理想、结果稳定、重复性好，为一种理想的新的封闭策略。
2.1 封闭效果检验
分别用免疫渗滤试验(先封闭后固相的封闭方法)和商品化HPV抗体检测试剂盒(按试剂盒说明书进行)检测40例宫颈癌患者血清和10例儿童血清，结果显示，免疫渗滤试验的灵敏度[82.5%(33/40)]和特异度[90%(9/10)]与商品化HPV抗体检测试剂盒的灵敏度[85%(34/40)]和特异度[80%(8/10)]，经Fisher确切概率法检验差异无统计学意义(P>0.05，表1)。表1 免疫渗滤法与商品化试剂盒检测HPV抗血清的结果比较（略）两种不同方法检测结果比较，P>0.05(Fisher确切概率法)。
2.2 特异性阻断吸附试验
随机抽取5份阳性患者血清，各取50μL分别加入等量的包被抗原，混匀，4℃过夜，10000r/min离心30s，同时用商品化抗HPV16L1抗体与抗原VLP共育后点膜，再行免疫检测，结果均为阴性。而用 20g/L BSA行相同处理后，检测结果为阳性。
2.3 敏感性试验
随机抽取5份阳性血清，用生理盐水按1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀释，混匀后各取50μL进行免疫渗滤法检测，结果显示在1∶4稀释的血清标本仍出现弱阳性。
2.4 稳定性和重复性试验
将第5种封闭方法制备的抗原膜片置37℃温箱2d和室温保存30d，与放置4℃的抗原膜片对照检测阳性血清和阴性血清，分批先后作5次试验，均获得相同结果。
3 讨 论
免疫反应是以其高度特异性为特征，利用免疫反应的特异性和敏感性已建立了许多临床检测方法。随着临床检测所需样品的微量化，检测过程/结果判读的快速化，如何保证结果的特异性就成为最受关注的问题。以往在免疫细胞/组织化学/蛋白印迹染色过程中对消除非特异性染色已有较多的报道，且积累了丰富的经验。在这些实验中，可以同时兼顾“速度”和“特异性”，为了最大程度获得特异性，可以多重/长时间处理以消除非特异性着色。但对于临床检测，特别是近年来以硝酸纤维素膜为载体的快速免疫分析，除准确性外，速度成为设计中最关键的参数。如何在基于硝酸纤维素膜为载体的快速斑点免疫渗滤分析的蛋白芯片制备过程中同时兼顾快速和特异性，是这一技术的关键[8]。目前最常用的非特异性染色消除方法是先在载体膜上进行点样，然后应用BSA或脱脂奶粉结合Tween 20、Tween 80、Triton X-100等进行封闭。工作中发现，这些方法虽然有一定的效果，但在封闭后的稳定性、重复性及抗原保存上仍不够理想[9]。本实验选择5种不同的封闭方法，结果发现以先点膜固相后再封闭，均不能得到理想的效果，而将1g/L的抗原与等体积的20g/L BSA预先混合，4℃共育过夜，然后固相于NC膜上，其封闭效果极佳，避免了BSA的浪费，点样后的抗原膜室温保存30d以上仍很稳定，且操作方便、灵敏度高、结果可靠。分析与对照实验出现误差的原因，可能是由于抗原的浓度不同而灵敏度也不同，以及与所选用硝酸纤维素膜的性能和质量、膜孔径大小和均一性不同有关。这些问题有待于进一步研究。
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