时间：2023-09-18 17:04:09
序论：在您撰写基因治疗的基本策略时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
关键词：硝苯地平；不良反应；牙龈增生
目前钙离子通道拮抗剂作为治疗高血压、缓解心绞痛的常用药，以其价格低廉、疗效显著及相对安全，在临床中被广泛应用。其常见的不良反应如：低血压、心动过速、颜面潮红、外周水肿、充血性心衰等，而近年来一些少见不良反应，尤其是该类药物导致牙龈增生的报道相继出现，逐渐引起临床医生的重视[1]。研究发现，在钙离子拮抗剂中，硝苯地平所致牙龈增生最为常见。本文就临床观察到的1例服用硝苯地平后出现牙龈增生的病例进行探讨。
1 资料与方法
1.1一般资料 将我院2015年3月接收1例服用硝苯地平患者出现牙龋增生者作为调查对象，冯某，男，44岁，高血压病10余年，最高血压170/120 mmHg，服用硝苯地平10 mg，1次/ d 3年余，查体：一般情况可，血压110/90 mmHg，心率70次/min，双侧牙龈增生，心肺腹查体阴性，双下肢对称性指凹性水肿。诊断：高血压病3级（极高危）钙离子拮抗剂所致双下肢水肿及牙龈增生，见图1。
图1 牙龈增生
1.2方法 停用硝苯地平，更换降压药为替米沙坦40 mg Qd美托洛尔23.75 mg Qd及短期应用利尿剂。
2 讨论
硝苯地平引起牙龈增生的发病率，国外文献报道为14%～83%，国内有文献报道为20.8%，通常表现为牙龈边缘和牙龈增生，质地坚韧、略有弹性，无痛，一般不出血，但多数患者会伴有牙龈炎症，出现牙龈出血、松软和颜色的改变[2]。
目前，硝苯地平致牙龈增生发病的分子及细胞学机制尚不十分明确，主要与胶原代谢紊乱、激素、炎症与免疫反应等有关，且其发病可能与多种易感因素有关，如遗传因素、个体易感性、用药剂量、疗程、菌斑指数及牙龈炎症、性别、年龄等，其中研究发现，不同人群对硝苯地平的反应不同，发生牙龈增生亦因人而异，即可能分为硝苯地平牙龈敏感型及硝苯地平牙龈耐受型，且用药剂量越大、用药疗程越长，其发生率越高，病变越重。亦有研究发现，口腔卫生条件差、菌斑指数高可加重牙龈炎症，是引起牙龈增生的独立危险因素，一般男性的发病率高于女性，大致为女性的3倍，考虑可能与硝苯地平阻止钙离子内流，使细胞外钙离子堆积，刺激局部雄性激素的代谢，从而促进成纤维细胞的增殖或使胶原酶释放减少有关，另有研究提示其发病率与年龄呈负相关，年龄越小发病率越高，随着年龄增长，其发病率降低[3-6]。
药物性牙龈增生的治疗，首先是停用可能有影响的药物，最好更换为其他类型降压药，大多数患者停药后数月内可自行缓解，对血压控制不好，无法停药的患者，最好采用联合用药，减少单药用药剂量，也能一定程度减少其发病率。对于一些中重度牙龈增生，还可就诊于口腔科，行牙周治疗，如菌斑控制、龈上洁治和龈下刮治、根面平整等，对于严重牙龈增生的患者还可行手术切除，然而该治疗仅为短暂缓解，术后复发率高，尤其是对于未停药、口腔卫生条件差或缺乏口腔护理的患者，因此保持良好的口腔卫生、定期行专业的口腔清洁、控制牙菌斑亦为重要的治疗方案[7-10]。
综上，药物性牙龈增生不仅影响咀嚼功能，同时会影响美观、加重牙龈炎症、产生口腔异味等，也有研究发现牙周疾病的慢性感染过程能够影响心血管系统，最终将形成恶性循环，不利于高血压与冠心病的治疗，故这一问题应该引起临床医生的重视，深入研究其发病机制，寻找更多更有效的治疗方案。
参考文献：
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关键词：基本医疗 医保费用 增长 控制
目前我国基本医疗保险已经覆盖12.95亿人，覆盖95%以上人口。随着我国医疗卫生体制的改革，覆盖面已经基本涵盖了城镇居民、农民及外出打工人群。人们在享受医疗保险带给我们医疗保障的同时，医疗费用的快速上涨，也给医保基金带来了沉重的负担。因此，若何有效控制医疗保险费用的过快增长，是医疗保险制度健康、有序、稳步发展的前提，是保障人民群众健康的物质基础，同时，也是医疗保险事业平稳运行的基石。本文结合医疗保险管理的实际，对我国医疗保险运行机构如何控制医疗保险费用的过快增长进行分析和探讨。
一、医疗费用过快增长的原因分析
引起次均医疗费用和就医频率增加的因素很多，从对部分省份医疗基金运行的实际情况分析，主要影响因素包括以下方面：
（一）正常医疗需求的增加。
一方面，基本医疗保险制度从无到有，居民生活水平不断提高，使人们的医疗需求得以正常释放，直接影响到了就医频率的增加。同时，2009年开始，各统筹地区为了合理控制医疗保险统筹基金的结余规模，分阶段、不同程度地对本统筹地区医疗保险待遇政策进行了调整。例如：提高医疗保险统筹基金年度最高支付限额和共付段医保基金支付比例、增设门诊大病病种等。在降低参保人员个人负担的同时，提升了参保人员的就医意愿，从而影响到了就医频率的增加。
另一方面，我国城镇职工参保人群年龄结构处于一个逐渐老化的趋势中，各种慢性疾病、危重病发生概率增加，直接导致就医频率和次均费用的增加。统计数据显示，退休人员的次均门诊费用与在职人员差别不大，次均住院费用、门诊就诊率和住院率却差别明显。
（二）以量补价的过度医疗现象普遍存在，推动医疗费用大幅增加。
受国家价格政策因素的影响，医疗机构通过提高医疗收费项目价格的创收途径受到制约，同时又由于我国绝大部分统筹地区均采用项目付费的结算方式，刺激了各医疗机构通过增加医疗服务提供量和种类来创收。以量补价的过度医疗情况已成为我国医疗费用不合理支出快速增加的重要原因。
（三）先进医疗技术在临床推广，对高级别医院的次均费用影响较大。
随着科学技术的迅速发展，新的医疗仪器设备、药品和诊疗技术层出不穷，极大地提高了诊疗水平，在解决疑难杂症方面起到了重要作用。与此同时，医疗技术的进步，其本身的高科技价值也带来了医疗费用的攀升。
二、控制医疗费用上涨的应对措施
医疗卫生资源的有限性与医疗服务需求的不断膨胀之间的矛盾，医疗保险筹资与支出之间的矛盾，医疗保险支出与积累之间的矛盾，是关系到社会保险事业持续发展的关键。根据医疗费用上涨的特点，在保障医疗需求合理增加的前提下，结合电力行业实际，应从以下几方面采取措施，控制医疗费用的快速上涨。
（一）加大医保政策宣传力度。
我国现行的是“低水平、广覆盖、保基本”的医疗保障制度和“以收定支、收支平衡、略有结余”的基金管理原则。医保部门应加强医保政策的宣传，使参保人员明白基本医疗保险保的是基本医疗，而不是特需医疗。基本医疗就是因病施治，进行合理的检查、用药及治疗。不根据病情需要，盲目要求医生多开药、开贵药，不仅不能对症治疗，还会给自己和医保基金造成浪费。
（二）加强政策引导，合理分流病人。
建立双向转诊制度，合理分流参保人员到适合自身疾病治疗的相应级别医院就医。为促使双向就诊制度的有效实施，医疗保险经办机构应积极主动延伸服务，一方面将各定点医疗机构收治的各类常见病的治愈率、次均医疗费用、平均住院天数、个人负担、病人满意度等多种信息定期对外公布；另一方面，对我国医技高超、医德高尚的医务工作者，医疗保险经办机构可以主动进行宣传，尽量减少病人和医院之间的信息不对称程度。
（三）实施医疗保险定点医生管理制度，强化医务人员的自律性。
随着我国五险合一的金保工程二期信息系统在部分地区范围内逐步推广使用，对医疗保险定点医疗机构精确化管理程度提高，管理落实到医生的条件已基本成熟。可以建立部分地区医疗保险定点医生库，制定定点医生诚信评判标准和激励机制，建议全国各省份人力资源和社会保障管理部门将医保定点医生的诚信状况作为医生职称评定的标准之一，提升医生提供医疗服务的自律性。
（四）加强医保稽核管理，确保基金安全。
加强医保稽核管理，加大对违规行为的查处力度，对参保人员将医疗卡、证转借他人使用，恶意骗取医保基金等各种违规行为，要加大查处打击力度，以此强化就医管理，促使参保人员规范就医行为。如：把医保稽核作为医保工作重心之一，通过加强对监管，有效遏制分解住院、降低入院标准、挂床、冒名住院、虚拟住院、过度治疗等不规范医疗服务行为，促进医疗服务质量的提高，维护参保人的权益。
（五）完善医疗保险定点医疗机构管理质量评价机制，实施定点医疗机构分级管理。
通过实施定点医疗机构分级管理，进一步改进定点医疗机构年度考核指标，并建立定点医疗机构管理激励和约束机制，变被动管理为主动管理。
虽然肿瘤的基因治疗在整个基因治疗的临床方案中占63％以上，但迄今为止在临床上仍无重大突破。这是由于基因治疗缺乏靶向性，基因的转染率和表达量都很低。同样用病毒治疗恶性肿瘤也成为研究的热点，如腺病毒ONYX－015、CV706，虽然也取得了某些进展，但没有重大突破，其原因是病毒治疗虽有靶向性，转染率也不低，但杀伤率较小。为此，我们提出癌症的靶向基因一病毒治疗策略，即以溶瘤病毒作为基因的表达载体(所谓溶瘤病毒即病毒只特异性地在肿瘤中复制而在正常细胞中不复制)，将溶瘤病毒治疗与基因治疗各自的优势相结合。其疗效既比单用基因治疗好，也比单用病毒治疗好，是今后基因治疗与病毒治疗的新趋势。目前，围绕此策略开展的一系列研究工作，正在不断深入之中。
癌症的靶向基因――病毒治疗
这一策略的基本方法是：将肿瘤特异性增殖病毒(溶瘤病毒)作为载体，在其中插入抗癌基因。我们使用的是经过改造的腺病毒载体，它可特异性地导向肿瘤，本身就有一点治疗作用，而且可特异性地在肿瘤中复制数百至数千倍，使所携带的基因也能特异性地在肿瘤中增殖数百至数千倍。
【关键词】口腔鳞状细胞癌；肿瘤；免疫基因治疗；综述
【中图分类号】R739.8 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）03-0456-01
1 口腔鳞状细胞癌简介
口腔鳞状细胞癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，其好发部位依次为舌、牙龈、颊、腭、唇、口底。鳞状细胞癌以角化珠形成及出现细胞间桥为病理学特征。肿瘤来自表面口腔黏膜上皮，肿瘤性上皮团或上皮岛浸润下方结缔组织，细胞特征可表现为丰富的嗜酸性胞质，胞核、核浆比大，程度不同的细胞及胞核的多形性，鳞状上皮形成的角化珠和单细胞的角化均可见。OSCC占口腔颌面部癌瘤80%以上，患者5年生存率约为50%，对于肿瘤晚期和复发患者，生存率更低[1]。因此寻找有效的治疗方法十分重要。经过过去几十年的发展，手术、放疗及化疗并没有显著提高口腔癌患者的生存率，化疗药物有明显的副作用，而且对复发的口腔癌患者生存率的影响尚不明确。研究新的治疗方法显得尤为关键。
许多研究表明：恶性肿瘤的治疗中，免疫治疗一直走在前沿，口腔癌患者特别是鳞癌患者，其细胞免疫功能早期就不同程度地受到伤害，再加上常规治疗方法（手术、放疗、化疗等）又可导致机体免疫功能的进一步下降。因此，口腔癌肿的最佳治疗策略应是包括免疫治疗在内的综合疗法。随着人类基因组计划的完成和口腔鳞癌发病功能基因的不断探明，肿瘤基因治疗这一生物治疗手段越来越受到大家的认可。自从1988年Rosenberg[2]提出要将肿瘤免疫基因治疗原理实际应用于临床起，学者们就对肿瘤的免疫基因疗法展开了深入的研究。
2肿瘤免疫基因治疗的概念
广义的肿瘤基因治疗概念认为，凡是能够改变肿瘤细胞或其他体细胞的遗传物质结构或功能，而达到治疗肿瘤目的的方法均属于肿瘤基因治疗的范畴。为区别传统的化疗及放疗导致的遗传物质结构或功能（核酸）变化，将肿瘤基因治疗定义为：以适当的基因转移技术将特定的外源遗传物质导入肿瘤细胞或患者体内，通过外源遗传物质的表达产物或对宿主细胞本身遗传物质表达的影响，直接或间接地杀伤或抑制肿瘤细胞[3]。从基因操作角度看，基因治疗主要有四种方法，及基因修正、基因置换、基因失活和基因修饰。近年来，免疫基因疗法在肿瘤的治疗中得到广泛应用。
肿瘤免疫基因治疗是依赖于机体免疫功能的间接杀伤。肿瘤免疫基因治疗的定义为：根据免疫学的理论论技术建立的、以基因转移技术为基础的、以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能为目的的基因治疗方法。免疫基因治疗的发展反映了整个肿瘤基因治疗历史，首例得到美国FDA批准的肿瘤基因治疗的临床计划是由Rosenberg[4]提出，用细胞因子基因体外转导修饰TIL，最后回输患者体内，治疗晚期恶性肿瘤病人。
3免疫基因治疗的方法
基因治疗在口腔鳞癌中的治疗前景包括用于治疗口腔鳞癌的复发和辅助治疗，例如作为外科手术后的辅助措施；发生局部远处转移的口腔癌患者也是基因治疗的应用方向之一。尽管全身用药理论上可以到达转移的病灶，但是基因治疗不适宜于全身输送。因为大多数原发和复发病灶是很表浅的，因此口腔癌患者非常适宜局部直接注射治疗。目前研究的用于治疗口腔鳞癌的方法包括：1）添加抑癌基因-基因添加疗法；2） 去除缺陷肿瘤基因-基因去除疗法；3） 减少刺激肿瘤生长的基因的表达-反义RNA；4） 增强免疫监测-免疫疗法；5） 前体药物活化起到化疗效应-自杀基因疗法；6） 病毒破坏肿瘤细胞的复制周期；7）呈送抗药基因给正常组织以防止化疗损伤。
4口腔癌癌基因的研究
迄今人们已在脊椎动物细胞中确定了32种与逆转录病毒癌基因同源的细胞癌基因，其中20多种与肿瘤发生有关。研究口腔癌癌基因的表达以及癌基因产物的形成，对从分子水平认识口腔癌的发病机制和生物学行为具有重要意义。Hoellering[5]等采用生物素化的H-ras，cDNA探针原位杂交技术和免疫组化技术，对5例口腔癌患者肿瘤组织中H-ras癌基因的mRNA及其产物P2蛋白进行定位研究，发现H-ras癌基因与mRNA的分布可能与口腔癌的生长方式及预后有关。且发现晚期口腔癌组织中均有ras和myc家族癌基因的扩增。在口腔鳞癌中，c-myc表达量较正常组高2～5倍，平均水平为0.34±0.16pg /μg，其它与口腔肿瘤有关的癌基因还有c-erb-B2、fes、mos、myb等，其中ab1基因在口腔上皮癌细胞株的表达与其脱壁生长特征有关。进一步研究口腔肿瘤中癌基因的各种变化，无疑对揭示口腔肿瘤的发生机制和指导免疫基因治疗具有重要意义。
5 口腔鳞癌的免疫基因疗法
免疫基因疗法治疗口腔癌有两种途径：一是增强肿瘤细胞的致免性，一是提高患者对肿瘤的免疫反应性。研究表明头颈部鳞癌患者有数种免疫细胞功能缺陷，包括自然杀伤细胞、T细胞、以及一些细胞因子。尽管口腔癌没有经典的免疫性，但是很多证据表明其具有免疫识别功能。已进行的动物研究包括给予IL-2诱导产生LAK细胞、TNF- A，将 IL- 2、IL- 4、IFN- C、IL-6或IL-1B转入肿瘤起到免疫调节作用联合应用非病毒脂质体表达的鼠白介素 2和多聚体表达的mIL- 12治疗口腔鳞癌，试验证明是可行并有效的[6]。mIL-2和mIL-12联合运用产生明显的抗肿瘤效应可能是由于其刺激增强了Tc细胞和NK的活性。此外，最新研究表明，应用缺陷型反转录病毒载体能够将TNF-α基因导入口腔鳞癌DNL中，带有TNF-α基因的DNL能够分泌高活性的TNF-α，表明口腔鳞癌DNL可作为基因转移的运载细胞用于口腔鳞癌的细胞因子基因治疗。
5.1 细胞因子与免疫基因治疗
在当前所开展的基因治疗研究中，免疫基因治疗的研究多集中于细胞因子基因治疗的研究。细胞因子的基因治疗避免了以往细胞因子注射疗法需反复多次给患者或动物模型注射大剂量细胞因子所带来的不良反应，也取得了细胞因子注射疗法所不具备的治疗效果。细胞因子基因治疗所选用的目的基因是可以编码表达包括ILs、IFNs、CSFs及TNFs等在内的各种细胞因子及其受体的基因[7]。依据将细胞因子基因导入体内的途径和原理不同，细胞因子基因治疗可分为以下几类：（1）以免疫效应细胞为基础的细胞因子基因治疗；（2）以瘤苗为基础的细胞因子基因治疗；（3）以抗原呈递细胞为基础的细胞因子基因治疗；（4）成纤维细胞等受体细胞为基础的细胞因子基因治疗；（5）直接体内注射途径的细胞因子基因治疗。
5.2 抗体与免疫基因治疗[8]
（1）抗体增强免疫基因治疗的靶向性：解决免疫效应细胞识别肿瘤细胞的特异性是肿瘤治疗的关键之一，研究表明将肿瘤特异性单链抗体基因导入T细胞中，使之分泌抗体，一方面通过抗体杀伤肿瘤细胞；另一方面通过抗体使特异性结合增加。
（2）抗体作为免疫基因治疗的效应分子：胞内抗体可用于肿瘤治疗。美国学者构建了一种编码单链抗体的载体（PGT21），将此载体转入高表达erbB2的卵巢癌细胞株SKOV3细胞中，可以通过胞内表达抗体erbB2单链抗体，抑制瘤细胞的生长。
（3）抗原与免疫基因治疗：在肿瘤治疗方面，经FDA批准，已有学者将编码CEA、Ig基因表达载体直接导入结肠癌和口腔鳞癌患者体内，临床显示其有一定抗肿瘤效应。
5.3 综合性免疫基因治疗
有研究表明，单一途径的免疫基因治疗效果并不理想，因此，将相互间有相加或协同效应的不同方法联合起来治疗口腔鳞癌的临床效应值得尝试。目前主要的研究方向有：细胞因子基因治疗与细胞因子基因治疗的联合；细胞因子基因治疗与B7等共刺激分子基因治疗联合；细胞因子基因治疗与MHC基因治疗联合；④细胞因子基因治疗与抗原基因治疗联合；⑤细胞因子基因治疗与自杀基因联合治疗。
6展望
综上所述，口腔颌面鳞癌免疫基因疗法发展至今，经历了从单一途径疗法转向多途径联合治疗的阶段，进一步提高了临床疗效。伴随着新的免疫基因疗法的不断问世，基因联合疗法的治疗效果更加明显，且不良反应也大大降低。同时，结合口腔鳞癌术前术后辅助疗法是可行的治疗方式，并有望进一步提高生存率。比较同期不同心的联合基因疗法的随机试验仍在进行中，这些试验将可能为治疗口腔颌面部鳞癌患者治疗中的作用确立1个新的位置。另外口腔鳞癌往往伴有第二原发肿瘤的风险，已经成为影响患者长期生存率的重要因素之一。免疫基因疗法对于第二原发肿瘤的影响如何，有待进一步研究。
免疫基因治疗是一种新兴的治疗肿瘤的方法。随着肿瘤分子生物化学研究的不断深入，我们能够拓展基因治疗肿瘤的方法，选择性针对肿瘤细胞。由于口腔鳞癌基因突变频繁，位置表浅易于瘤内给药，因此基因治疗适合运用于口腔鳞癌。基因疗法用于Ⅰ期的头颈部鳞癌是安全有效的；对于Ⅱ期鳞癌，联合放疗或化疗，也能起到抗瘤效应；作为辅助措施治疗Ⅲ期鳞癌的正在进一步研究中。以后的研究方向在于建立起安全有效的利用免疫基因疗法治疗口腔鳞癌的方法体系。
参考文献
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【中图分类号】 R734.2【文献标识码】 B【文章编号】 1007-8517(2009)24-0100-01
肺癌是常见的恶性肿瘤之一,目前治疗是以手术、化疗、放疗为主,联合生物治疗、中医中药治疗等的综合治疗模式,但随着肿瘤分子生物学、免疫学以及分子生物学技术的发展,肺癌生物治疗不断被赋予新的内容,治疗方法逐渐扩展到基因治疗、免疫治疗以及近年来兴起的分子靶向治疗[1],为肺癌治疗开辟了更为广阔的前景。本文就肺癌生物治疗的现状及研究进展综述如下。
1 肺癌生物治疗现状
生物治疗的原理是通过为肿瘤患者补充具有杀死、抑制肿瘤能力的免疫细胞和能力,调节患者自身免疫功能,达到控制和清除肿瘤细胞的目的,主要包括细胞因子技术、基因治疗技术、肿瘤疫苗技术、免疫活性细胞继承性输注技术、单克隆抗体及其耦联物技术等[2],彼此之间并没有明确的界限,它们的出现标志着肿瘤生物治疗体系的基本形成,虽然途径与方法各异,但目的都是通过最大限度的利用人体自身所具有的抗肿瘤能力来治疗恶性肿瘤。生物治疗有自己独特的优点,毒副反应较低.仅在高剂量时有低血压、发热皮疹、抗原抗体反应等,发生率较低[3],临床上治疗肺癌应用最多的为细胞因子,免疫调节剂、基因治疗和分子靶向治疗药物也已应用于临床,过继免疫细胞中淋巴活化杀伤细胞(LAK)已见报告,为今后生物治疗的发展研究提供了丰富的内容。
2 肺癌生物治疗研究进展
2.1 分子靶向治疗肿瘤分子靶向治疗是利用分子靶向药物特异性,以肿瘤组织或肿瘤细胞中所具有的特异性分子为靶点,阻断该靶点的生物学功能,或选择性从分子水平来逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为,从而达到抑制肿瘤生长甚至肿瘤消退的目的[4]。其中以表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤血管生成作为靶点的药物占60%,以表皮生长因子受体作为靶点的治疗药物包括吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗等,以肿瘤血管生成作为靶点的治疗药物包括贝伐单抗、ZD647、内皮抑素、基质金属蛋白酶等,其它靶向治疗药物如基质金属蛋白激酶(MMPs)抑制剂、血管生成因子抑制剂、法尼基转化酶抑制剂(FTIs)、环氧化酶抑制剂、组氨酸脱乙酰化酶抑制剂等分子靶向性药物正在进行临床前或临床试验研究中[5]。
2.2 细胞因子治疗 常用于肺癌的细胞因子有干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、红细胞生成素(EPO)和集落刺激因子(CSF)等。细胞因子的应用是目前最成熟的生物治疗方法,尤其是IFN和IL,目前已经在肺癌治疗中应用非常成熟,CSF、TNF、EPO等也逐渐被广泛应用,在肿瘤的治疗中起到了重要作用。IFN是最早发现具有抗癌效应的细胞因子,早在1980年第一次用于小细胞肺癌(SCLC)的实验中就显示出了良好的前景。IL一24是近来发现的一种新白介素,利用腺病毒转染的方法发现其可以抑制肺癌细胞的增殖并可以增强肺癌细胞对放疗的敏感性。CSF及EPO的应用对于克服骨髓抑制、预防传统放化疗所产生的白细胞下降及红细胞减少无疑起到了保驾护航的作用,为提高放化疗药物的使用剂量从而达到更好的治疗效果起到了关键作用[6]。
2.3 免疫治疗 主要包括肿瘤疫苗、过继性免疫治疗及补充细胞因子,其中发展最快的是肿瘤疫苗。目前应用的肺癌疫苗有肿瘤细胞疫苗、胚胎抗原疫苗、病毒疫苗、癌基因产物疫苗、人工合成多肽疫苗、抗独特型疫苗和树突状细胞疫苗等,树突状细胞疫苗能形成强有力的特异性细胞免疫应答,有效地清除血源性播散的肺癌细胞,发展最为瞩目[7],Ueda等应用CEA652体外冲击致敏树突细胞,治疗CEA阳性的肺腺癌患者,发现治疗后患者病情稳定,血清中CEA水平明显降低。受到重视的还有第3代疫苗:核酸疫苗,包括DNA疫苗和RNA疫苗, DNA疫苗在体内可持续高表达相应抗原,被树突细胞摄取并致敏后,激发高效的细胞和体液免疫反应,是最有潜力的肿瘤疫苗发展方向。
2.4 基因治疗
2.4.1p53基因治疗 在基因治疗研究中,以腺病毒转染抑癌基因p53的表达研究较为成功。国外对重组腺病毒介导的p53基因治疗NSCLC的临床研究已基本完成,结果显示腺病毒p53注射液在NSCLC中有抗瘤活性。一项研究中,对12例气道阻塞且无法手术的肺癌患者瘤内注射重组腺病毒p53注射液106―1011pfu,28天重复一次,其中6例患者症状得到缓解。然而也有研究者将重组腺病毒p53注射液联合化疗治疗NSClC,发现两组疗效和生存期无显著差异。
2.4.2 杀伤基因将具有杀伤作用的基因片段导入细胞复制的DNA序列中,从而打断细胞基因的连续性,抑制基因的过量表达和肿瘤细胞的增殖。自杀基因和凋亡基因通过引发肿瘤细胞的凋亡而起到杀伤肿瘤细胞的作用。TK基因-GCV系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一,在肺癌基因治疗中具有显著作用。
2.4.3 RNAi技术 在针对肿瘤的基因治疗策略中,RNAi技术以其自身的诸多优势,在不影响正常基因功能的前提下,可以针对在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因、血管生成因子及其受体以及部分关键酶等,抑制突变基因表达或基因的过量表达。如Zhang等用HER-1 siRNA抑制了肺癌细胞A549的EGFR的表达,使肺癌细胞比对照组细胞数减少了85%,EGFR蛋白表达下降了70%以上,对顺铂的敏感性增加了4倍。
3 展望
作为一种新的治疗模式,生物治疗目前还存在很多问题,如各种治疗药物的有效性、安全性还有待于进一步评价,是否有必要采用特异性检测手段筛选分子靶向药物的适应人群来实现个体化用药,及建立这类药物与手术、放化疗之间的最佳联合方案还需不断摸索。但我们深信在不久的将来,随着对肿瘤生物学特性和行为了解的不断加深、分子药物研究的不断发展,将会出现一批新型的低毒、高效靶向治疗药物,为肺癌乃至其他所有肿瘤患者带来福音。
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【关键词】 六味地黄丸/药理学 肝肿瘤/中西医结合疗法 肿瘤/病理学 细胞凋亡 基因疗法 自杀基因
疾病模型，动物； 小鼠
肝癌的基因治疗，特别是自杀基因治疗，在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发和转移，以及提高病人生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域［1-3］。从已有的研究结果来看，单纯自杀基因治疗仍难以达到完全根治肿瘤的目的。因此，寻找自杀基因疗法的增效方法是目前各种肿瘤自杀基因治疗的研究热点之一。
免疫机制是旁观者效应产生的重要机制［4-5］，改善自杀基因疗法作用的炎症免疫微环境是自杀基因疗法增效的主要途径［6-7］。六味地黄丸具有增强机体免疫功能和直接抗肿瘤作用［8-13］，我们前期的研究结果显示其对小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自杀基因治疗具有增效作用［14］，本文旨在观察其疗效的病理学机制，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 细胞培养瓶、培养板、滤膜、冻存管等为美国Corning公司和丹麦NUNC公司产品；Polybrene和G418为Sigma公司产品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。主要仪器为BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC），亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）等。
1.2 动物 昆明种小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：2003A008）。
1.3 细胞株 病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内记为PT67/tk［15］；小鼠肝细胞癌细胞株H22购自中山大学实验动物中心细胞库。
1.4 药物及配制 六味地黄丸为北京同仁堂产品（批号：4030098），于无菌室内用消毒研钵加少许消毒蒸馏水研磨后，配成浓度为500g/L的药液，小鼠给药剂量为生药10g·kg-1·d-1；丙氧鸟苷（GCV）为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品（批号：040701），于无菌室以注射用生理盐水25mL溶解，浓度为10g/L，小鼠给药剂量为100mg·kg-1·d-1。
1.5 小鼠肝细胞癌细胞株H22的感染及GCV体外杀伤效应的观察 复苏包装细胞PT67/tk，吸取其培养上清液，加入H22的培养液中，上清液病毒感染H22细胞后用G418(800mg/L)筛选，获得抗性细胞克隆，命名为H22/tk，将H22/tk和野生型H22细胞分别以2×103、3×103、5×103个/孔接种96孔板，同时加入不同浓度的GCV使终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的细胞孔作对照，每一个浓度设4个复孔，于倒置显微镜下观察杀伤效应。
1.6 造模及治疗
1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 将H22/tk和野生型H22按1：4混合（模拟临床体内病毒感染肿瘤细胞比率10%～20%）。混合后的细胞制备成1×1010个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数＞90%；按0.2mL/只（含2×106个肿瘤细胞）细胞悬液接种于小鼠的皮下。
1.6.2 分组及治疗 昆明种小鼠90只，随机分为5组：正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗组、联合治疗组（自杀基因联合六味地黄丸），正常对照组10只，其他组各20只。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水0.2mL，其他各组右前肢腋下接种肝癌细胞悬液0.2mL。正常对照组和模型对照组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；六味地黄丸治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；自杀基因治疗组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；联合治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。
1.7 疗效观察及病理学机制
1.7.1 肿瘤质量及抑瘤率 实验结束后处死动物，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量，记录结果。计算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。
1.7.2 病理学观察及半定量分析 肿瘤用体积分数10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤细胞的密度、肿瘤坏死、间质反应，并采用盲法评分。肿瘤细胞密度：根据肿瘤细胞大小及密集程度分为+、++、+++3个等级。坏死分为+：灶状坏死；++：网状多灶状坏死；+++：大片状坏死。纤维结缔组织根据肿瘤间质内及瘤周纤维的增生情况由低到高依次分为+、++、+++3个等级。肿瘤细胞核分裂像计数方法为每张HE染色切片随机取5个非坏死区域高倍视野，对核分裂像进行计数。
1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫组化染色及阳性细胞计数 采用免疫组化SP法。切片脱蜡至水，入体积分数1%过氧化氢溶液20min；磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封闭液，20min；滴加增殖核抗原抗体，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素标记二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；联苯二胺(DAB)显色，10min，Mayer苏木素复染5s，干燥后中性树胶封片。胞核呈棕黄色为阳性细胞，每张切片随机取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞个数并取平均值。
1.7.4 肿瘤细胞凋亡的检测 采用原位末端标记（TUNEL）法。切片脱蜡至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反应液，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入体积分数0.3%的过氧化氢，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer苏木素复染，干燥后中性树胶封片。以胸腺组织为阳性对照，不加末端脱氧核苷酸转移酶作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为阳性细胞，每片随机选取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞的个数，以同一视野内阳性细胞占总细胞的百分比表示细胞凋亡指数：p凋亡/%=(n阳性细胞/n总细胞）×100%。
1.8 统计学处理 计量资料采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析；等级资料采用Ridit分析。
2 结果
2.1 体外杀伤效应 铺板48h后，H22/tk100mg/L浓度孔中细胞开始死亡，表现为胞膜不完整，轮廓模糊，不透亮，形状不规则，并且碎裂成小粒状；10mg/L以下组仅见极少数细胞死亡，且增殖明显。野生型H22细胞均呈现明显的细胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上浓度孔中绝大部分细胞碎裂成小粒状，孔内基本无活细胞生存；其他包括野生型H22细胞孔均呈现明显的细胞增殖。表明体外病毒感染肝癌细胞成功，病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性，可用于体内治疗的实验研究。
2.2 肿瘤质量及抑瘤率 表1结果表明，各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻，其中联合治疗组与模型对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05）。
2.3 病理学观察及半定量分析 各组肿瘤细胞均表现为大小不一，核大深染，形状不规则，肿瘤间质内及瘤周有不同程度的纤维结缔组织增生，肿瘤组织内均可见不同程度的大片坏死。模型对照组与六味地黄丸治疗组均见肿瘤组织内细胞密度较大，自杀基因治疗组与联合治疗组见肿瘤组织内细胞密度较低，仅自杀基因治疗组肿瘤细胞密度与模型对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），见表2，图1。
2.4 肿瘤细胞的增殖与凋亡 六味地黄丸治疗组和联合治疗组核分裂像明显少于肿瘤模型组和自杀基因治疗组，其中联合治疗组核分裂像最少。增殖核抗原阳性细胞着色部位位于细胞核，呈黄褐色，六味地黄丸治疗组与联合治疗组阳性细胞数均少于其他两组，以联合治疗组阳性细胞数最少。各治疗组肿瘤细胞凋亡较模型对照组明显增多，以联合治疗组最明显，见表3，图2-4。表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较表2 各组病理分析统计结果表3 各组肿瘤细胞增殖与凋亡检测结果
3 讨论
自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因。目前常用的自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，而这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡［16］。
HSVtk/GCV为目前研究最深入、最具有应用前景的肿瘤自杀基因治疗系统之一，已广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，并已进入Ⅲ期临床实验。HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致细胞死亡［17］。
自杀基因治疗由于存在旁观者效应（bystander effect）的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最具有应用前景的肿瘤基因治疗方法。所谓旁观者效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［18］。由于存在旁观者效应，自杀基因疗法对肿瘤细胞的杀伤作用被有效地放大。旁观者效应形成机制的假说主要包括［18］：(1)"缝隙连接"机制；(2)免疫介导机制；(3)"细胞凋亡"机制；（4）介质机制；(5)抗肿瘤血管生成机制，等等。
由于免疫介导机制在体内自杀基因疗法旁观者效应中的重要作用。改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。现代药理学研究结果表明，滋阴补肾代表复方六味地黄丸（汤）对机体细胞免疫和体液免疫均有明显的增强效应；能明显改善荷瘤机体的免疫状态，并具有一定的直接抗肿瘤作用。我们以六味地黄丸的免疫药理作用与肿瘤自杀基因疗法旁观者效应的免疫介导机制之内在联系为研究的切入点，以实验性肝细胞癌为治疗对象，比较研究了自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗与单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗的抗肿瘤效果。研究结果显示：联合治疗组对肿瘤生长的抑制作用较单纯自杀基因治疗组或单纯六味地黄丸治疗组更为明显［14］。
在进一步的病理学研究中，虽然病理学观察表明自杀基因治疗组与联合治疗组的肿瘤组织内细胞密度较低，各治疗组纤维组织增生均较明显，但通过盲法对肿瘤的病理定量分析研究则显示肿瘤细胞密度、肿瘤坏死、间质反应各组间差异均无统计学意义。造成这种现象的原因最有可能是观察者不能很好地把握分级标准，以及病理半定量分析的不够精确，这有待于通过多次的重复实验及增加样本量或运用更为精确的分析方法（如图像分析等）来解决。 肿瘤的生长速度与肿瘤细胞的增殖与凋亡速度相关。PCNA与细胞核分裂像均为评价细胞增殖能力的重要指标。本实验结果显示：联合治疗组与六味地黄丸治疗组的PCNA阳性细胞数及核分裂像数均少于模型组、自杀基因治疗组，其中联合治疗组与模型组、自杀基因治疗组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，结果说明六味地黄丸可能具有一定的抑制肿瘤增殖的作用；其他各组间的差异均无统计学意义，而自杀基因治疗组从绝对值看略高于模型对照组，其结果与文献报导自杀基因治疗后残存肿瘤细胞会加速增殖相符。同时，从本实验结果来看，各治疗组肿瘤细胞凋亡均有增多，联合治疗也显示了更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。
本研究结果提示：肿瘤细胞增殖抑制和肿瘤细胞凋亡增多都与六味地黄丸对肝癌自杀基因治疗的增效作用有关。其机理可能是在六味地黄丸的参与下，不仅发挥了直接抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的功效，而且通过对机体整体与局部的抗肿瘤免疫的调节或其他机制（如"缝隙连接"机制等），使得自杀基因治疗的旁观者效应在力度上得以增强，在时限上得以延续，从而更好地发挥了自杀基因疗法的抗肿瘤作用。
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【关键词】超声微泡；双自杀基因慢病毒载体；基因治疗
【中图分类号】R341 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0013-02
目前，基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是一种颇具临床应用潜力的治疗策略， 但是由于治疗的靶向性成为关系到治疗安全性的瓶颈问题。近年来研究表明[1-5]，超声微泡造影剂有望成为一种新型的体内靶向给药的载体系统。本研究旨在构建超声微泡包裹的特异性双自杀基因慢病毒载体，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的构建与包装
1.1.1目的基因的扩增与TA克隆
提取正常人外周血gDNA，并通过PCR方法扩增出KDRP、CD、TK基因；回收
PCR产物并分别将其链接到pMD18-T载体上，构成重组T质粒；抽提质粒，并对各重组T质粒的酶切鉴定及测序；
1.1.2 慢病毒载体构建与包装鉴定
将经测序证实的T-KDRP、T-CD、T-TK三种质粒上的KDRP、CD、TK元件通过特定的限制性内切酶酶切后，依次连接到经相应酶酶切的pLenti6-EGFP载体上，经脂质体法转染至293T细胞，24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达，72h后收集上清，0.45um滤器过滤，25000rpm离心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液，加入293T细胞中，72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。按公式计算病毒滴度：
病毒滴度=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数/0. 4m1（pfu/ml）。
1.2 载药粒微泡的制备于鉴定
1.2.1载药粒微泡的制备
声诺维sonovue为磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用说明注入生理盐水5 ml震荡形成微泡混悬液。取50ul微泡悬液于1.5mlEP管内，再滴加入100MOI病毒载量的病毒上清液，轻轻混匀后室温孵育20 min。
1.2.2载药粒微泡的鉴定方法。
采用Malvern激光测量仪检测载药微泡的粒径大小，光学显微镜观察其外观，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量。
（1）粒径大小比较
载质粒微泡为白色混悬液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。去除上层及下层液，取中层液，测定其粒径大小，镜下比较观察载药微泡与空白微泡外观。
（2）包封率的测定
将制备好的含有慢病毒载体的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混匀，6℃，16000 rpm高速离心20min，去上层微泡，取下层液体，加5%乙醇0.5 mL稀释冲洗，再加入适量乙醚，漩涡振摇，6000 rpm离心15 min，取乙醚层，50℃水浴挥干后，加0.5 mL甲醇溶解作为样液，进样量10μL。采用RP-HPLC测定双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式计算包封率：
包封率（%）=[（投入药量―游离药量）/投入药量]×100%
（3）载药量的测定
以下式计算载药量：
载药量%=（Wt～Wi）/Wc×100%
其中Wt为脂质微泡溶液中药物总含量，Wi为游离药物量，Wc为磷脂用量。
（4）稳定性测定
4℃冰箱贮存，对短期内的载药微泡溶液的质量进行监测。
取少量载药微泡混悬液分别于1d、2d、5d、8d、10 d经光学显微镜（×400）进行观察其形态变化。第10 d的取该样品由Malvern粒径测量仪检测粒径。4℃冰箱贮存10 d后，RP-HPLC测定载药微泡溶液的包封率。
2 结果
2.1 病毒滴度检测结果：
经荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度，获得病毒滴度为（3.5×1012pfu/L）的双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。
2.2 载药微泡质量鉴定：
2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的声诺维微泡与空白声诺维微泡粒径的对比观察：
载质粒微泡呈乳白色混悬液，用磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate buffered saline PBS）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。
镜下比较观察载质粒微泡（图A）与空白微泡（图B）的形态，其形态相近，为近似的圆形微泡。其粒径范围92%在2～5μm之间，平均粒径约2.90μm（图A），粒径大小均相似。
2.2.2 包封率和载药量测定结果
采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量，
得到结果：
包封率为90.6±3.1%。载药量为29.2±0.9%。
2.2.3 稳定性测定：
4℃冰箱贮存10 d后，可见仍为乳白色混悬液，光镜下观察，微泡粒径大小未见明显变化，微泡形态好，大小均匀，相互之间无明显聚集现象，分层情况基本同前，样品经光镜下观察及Malvern测量仪检测发现，与制备初始相比，平均粒径大小约3.08μm），未见明显变化；RP-HPLC测得包封率：86.1±2.8%，没有出现明显药物渗漏。
3 讨论
基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是近年来新兴的肿瘤基因治疗的研究热点。自杀基因疗法是利用基因工程技术将自杀基因转入肿瘤细胞进行表达，注入体内的无毒或低毒的前药在表达的特异性酶作用下转化成毒性产物，该产物可作为DNA合成的核苷替代物掺入到DNA中，干扰细胞DNA的合成，从而引起肿瘤细胞的死亡[6]。
本研究所采用的克隆方法并不是将PCR产物直接与表达载体相连接，而是先将PCR产物TA克隆，构建成重组T质粒后再将目的基因与表达载体酶切连接，主要是考虑到：PCR产物直接进表达载体成功率不高；而先进T载体，再酶切连接表达载体，可减少碱基错配，提高成功率。目前己发现的自杀基因体系已有十多种，本实验选择胞嚓陡脱氨基酶基因（CD）和单纯疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK简称TK）来构建双自杀基因质粒，是因为研究表明[7]，二者作用机制具有很强的互补性，将其连接在一起，构成融合基因，使两个自杀基因体系协同作用，能显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。同时选用肿瘤特异性启动子KDRP，突破对肿瘤细胞类型的依赖性，扩大肿瘤基因治疗谱。运用增强型GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，可直观的检测目的基因的检测和计算病毒滴度。而慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞，容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期地表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒，己成为当前基因治疗中载体研究的热点。
超声微泡造影剂声诺维可作为一种新型基因载体。在一定剂量超声波的辐照下，利用微泡在超声介导下的空化效应介导目的基因的靶向释放和导入。国内外许多学者通过体内外实验证实空化效应是超声介导基因转染的主要机制，微泡造影剂作为外源性空化核被引入体内后大大增加了单位体积内空化核的数量，降低超声波的空化闭值，增强空化效应，从而提高基因转染效率[3-4]，尤其在抗肿瘤治疗、溶栓治疗等方面具有潜在的重要应用价值。经静脉注入载药微泡后，用超声辐照特定部位，含气体的超声造影剂在超声波作用下会不断地产生非对称性收缩和膨胀，当声能达到一定强度时，微泡破裂药物被释放到超声所辐照的局部组织中。在这一过程中，微泡作为空化核增强空化效应，依靠能量辐射作用，使微泡破坏后释放的药物能够进入血管壁甚至组织间隙，从而发挥定位靶向治疗作用[2]。
而载药微泡的外观、粒径大小、包封率、载药量等是衡量载药脂质微泡质量的最重要指标。我们制作的载双自杀基因慢病毒载体微泡乳化良好，大小均匀，粒径范围92%在2-5μm，与空白微泡相似。微泡内药物的包封率为90.6±3.1%，载药量为29.2±0.9%，均达到较理想的水平。此外稳定性也是衡量载药脂质微泡特性的主要指标之一，它能反映脂质微泡溶液包封率随时间变化的情况。脂质微泡作为药物载体稳定性是指被包裹药物在脂质微泡中的滞留性。经由本实验证实，我们制作的载药微泡同时也具有较高的稳定性。
本研究联合了双自杀基因的杀伤效应、KDR启动子的肿瘤特异性、慢病毒载体的高载性和超声微泡靶向的可控释性等多种技术优点，制备出了较为理想的载有靶向基因药物的微泡，期望为进一步临床实施可视状态下的肿瘤的基因治疗提供一种更加安全、高效的策略。
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作者简介：
郝轶，硕士，主治医师，新疆医科大学附属肿瘤医院，830011。
基金项目：
新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝轶）
