时间：2023-08-30 16:26:45
序论：在您撰写海绵城市的建议时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
关键词：海绵城市；城市环境；作用及浅析
引言：主席高度重视城市化发展的质量，并且发表了“加强海绵城市建设”的讲话，明确指出要大力构建“海绵城市”。目前海绵城市理念在多个发达国家，如美国、加拿大、新加坡、日本等都发挥了巨大的功效，我国海绵城市理念的提出相对较晚，要善于借鉴发达国家的成功经验。建设海绵城市，是实现城市建设和自然生态系统协调发展重大举措，从根本上解决“城市病”，推动我国城市发展早日走上生态化、持续化的道路，实现城市发展的可持续。
一、海绵城市的概念和特征
1.海绵城市的概念
我国《海绵城市建设技术指南―――低影响开发雨水系统构建》中对海绵城市的概念进行明确了定义：指城市能够像海绵一样，在适应环境变化和应对自然灾害等方面具有良好的“弹性”，下雨时吸水、蓄水、渗水、净水，需要时将蓄存的水“释放”并加以利用。在这一“吸”一“收”的过程中实现了城市内部良性的水循环系统，还能自动吸收水系统的污染物质，保持城市水土。
2.海绵城市的特征
第一，注重城镇化和自然环境的协调发展，在对城市地下水、自来水等进行存储、排放、使用时不是依靠传统的地下管道而是依靠城市自然环境综合利用各种措施吸收、存储大气降水和地下水，进而缓解城市的洪涝问题；第二，让城市“弹性适应”环境变化与自然灾害，海绵城市建设思路不仅注重恢复和保持城市内部的水系统，更注重原有自然生态系统的保护，重视城市系统的自我调节；第三，转变了排水防涝思路，海绵城市彻底摒弃了“快排式”传统的排水模式，在城市排涝过程中始终坚持“渗、滞、蓄、净、用、排”的六字方针；第四，开发前后的水文特征基本不变，海绵城市构建了一个良性的水系统。
二、分析“海绵城市”对城市环境的作用
根据《指南》的相关规定，海绵城市建设规划实施的主要内容包括以下几点：：一是充分保护城市原有生态系统；二是对已经受到破坏的自然环境及水体进行修复；三是低影响开发。海绵城市的建设对解决城市内涝问题、调节地下水、净化水中污染物质、维护自然生态环境的多样性、美化城市环境等发挥了巨大功效。
1.缓解城市内涝问题
海绵城市建设理念在城市发展过程中的应用，起初就是从解决城市雨洪问题出发，发挥着雨洪调蓄、雨水资源收集利用与地下水涵养等作用，完善城市雨水管理体系。海绵城市的建设，改变了以往单纯使用市政地下排水管道和泵站的现状，侧重于依靠城市自然生态系统来吸收、存储、排放降水，综合利用自然生态调节和人为调节措施来缓解城市内涝问题。
群力雨洪公园是海绵城市建设理念运用的一大成功案例。该区域在历史上是洪涝灾害多发区，在对其进行设计的过程中，以保护湿地为原则，巧妙的将其打造成收集雨水、储蓄雨洪、下渗雨水、补充城市地下水、涵养水源、净化水中污染物质、增加生物多样性等功能于一体的湿地公园。在具体实施的环节中，尽量保持原有的湿地区域，群力雨洪公园成功的运用了海绵城市建设理念，湿地公园的开发，为调节湿地公园的生态系统发挥了巨大的作用。
群力雨洪公园的成功案例实现了缓解城市内涝带来的问题和危害，增强城市排水系统的能力，通过协调市政道路和地下排水管之间的关系，增大城市的绿色植被覆盖率，完善城市水系统等措施来达到排涝的目的，确保在雨季时城市市民依然享受安逸的生活。
2.形成良性的水循环系统
海绵城市的建立，不仅有效的减轻城市洪涝灾害，还能够缓解我国水资源不足、水质恶化的局面，为建立良性的水生态系统提供助力。
武夷新区践行“海绵城市”在此方面取得了非常成功的效果。其主要理念体现在以下几个方面：一是注重对森林生态的修复工作，闽北地区原生态的森林在被人为的滥砍乱伐之后正呈现急剧下降的趋势，鼓励当地林农还林于上，加大对林业种植的补贴力度；二是城市生态修复同样不可忽视，一些贴近地面的建筑如广场、硬地、建筑等工程在材料的选择上采用通气、透水性较好的；三是恢复和修复自然生态环境，保持生态物种的多样性，扩大生态用地的面积，净化水资源，淡化水质，减少暴雨对城市的影响。
笔者认为，海绵城市就像被放大了的“湿地”一样，最大程度的修复城市原有的水生态系统，注重开发雨水的渗透、调蓄、净化、利用等综合作用，实现雨洪资源的有效利用，使地表径流和地下径流维持着一定的径流量。森林植被、湿地等大大提升地下水的涵养能力，净化水质，吸收水中的污染物质，确保居民生产和生活用水的安全性，促进雨水资源的利用和生态环境保护，同时实现地表水、地下水和自然降水三者之间的平衡循环。
3.保持城市水土
不可否认，城市水土保持是实现涵养水源、防风固沙、提供动植物栖息地等的关键，而海绵城市的建设，又能够给城市水土保持工作的雨水控制环节提供便捷。在建设海绵城市的过程中，做到了开发前后的水文特征基本不变，始终坚持低影响开发的原则，城市水土保持离不开对雨水的控制。
比如，我国投资建设的重庆海绵城市，其建立了完整的防水控制，也因为重庆地处高原，山地较多，在进行海绵城市建设的时候发展了绿化工程，让绿色植被对城市的水土进行保持。雨水较多季节植被能够吸收水分，保持水源，对于雨水能够做到有效控制。并且，绿色植被与重庆城市的人文特征相符，也是海绵城市与其人文气息相得益彰构建之处。
鉴于此，笔者从海绵城市建设和城市水土保持出发提出以下建议：一是结合海绵城市建立起合适的雨水控制利用设施，做到真正的系统优化；二是加强对水土保持工作的监测，纠正雨水控制期雨水控制的不当之处；三是注重低影响开发理念和水土保持临时排水措施相结合；四是政府部门要积极引进和开发雨水利用控制系统的新工艺、新技术、新手段等。
4.改善城市的人文和自然景观
在实施“建设海绵城市”的规划策略时，对居住区和城市道路进行分割，增大了建设绿地的用地面积，合理的修建了广场，广场铺装多采用透水式铺装，城市道路人行道也采用了透水式铺装的方法，增强了城市内部的水循环系统；另外，城市内湿地、公园面积增大，提供了良好的生态环境。
比如，嘉兴海绵城市的建设，便是对居住区和城市道路进行有效规划，开垦绿地面积，增加绿化建设，让百姓在享受到其“海绵”作用的同时还能够欣赏到美丽景色，增添了城市的人文气息，美化了城市的自然景观，可以说是一箭双雕。嘉兴海绵城市建设是全国海绵城市建设的标杆，也得到了全国各地的争相效仿。
结语：
海绵城市的建设是实现城市化和自然生态系统协调发展的有效途径，有力克服了城市化发展过程中的问题。当前，无论城市规模的大小，建设海绵城市已经是大势所趋，其推动了新型城镇的建设，在城市化发展中贯彻落实了以人为本的思想理念。
参考文献
[1]仇保兴. 海绵城市（LID）的内涵、途径与展望[J]. 给水排水，2015，03：1-7.
关键词：海绵城市；生态环境；雨水花园
中图分类号：S26文献标识码：A文章编号：16749944（2016）18016203
1引言
中国是水资源严重匮乏的国家之一，水资源人均占有量不足世界人均水平的1/3。近年来，随着城市化进程的不断加快，水资源短缺和污染问题在城市发展过程当中尤为突出。在城市生态系统中，某些城市存在城市供水不足，城市建设用水安全等问题，而有些城市的工业污水也造成城市生态系统恶化，生活用水得不到保障[2]。因此，合理有效地利用水资源，缓解城市用水压力，优化水资源利用、排放、净化模式就成为社会各界广泛关注和研究的重点问题。基于此，本文就针对海绵城市建设过程对雨水的处理利用问题进行分析，并提出一些合理化意见和建议[3]。
2海绵城市的内涵
海绵城市是指在城市发展建设过程中，充分发挥道路、城市水系、建筑以及绿地等设施对雨水的吸收、渗透、储存、净化和缓解作用，控制雨水径流，如同“海绵”一样，对于环境的变化和突发的自然灾害等方面具有良好的适应性，也就是“弹性”。“海绵城市”一词的提出是在新时期下，为了缓解和解决我国飞速发展的城市化与脆弱的城市水体矛盾而提出的，“渗、蓄、滞、用、排”五位一体，落实：“节水优先、空间均衡、系统治理、两手发力”的原则。
海绵城市的发展理念在国外提出较早，主要思想是解决城市雨水问题，它包括：低影响开发（LID）、最佳管理措施（BMP）、绿色基础设施（GI），相关理论研究的目的是有效控制农村以及城市的面状污染源＼[3、4＼]，随后逐渐发展成为控制降雨径流量和水质的生态可持续的综合性措施。而其中又以低影响开发理论为核心，即基于生态文明和景观建设为主的雨水管理方法，主要是在一定的区域内利用软工程技术，通过植被自身的特点实现就地处理降水，直接减少地表雨水径流量[5]。也就是说从源头控制雨水径流，其具体的方法包括建设雨水花园、绿色屋顶、城市下凹绿地等设施；发挥城市绿地、道路、建筑对雨水的吸收、蓄存和缓释作用，有效改善城市内涝，削减地表径流，改善城市的生态环境[6]。
3海绵城市建设过程中应注意的主要问题相对于国外而言，我国海绵城市建设起步较晚，目前处于试点阶段[7]。但“海绵城市”的发展理念已成为新型城市价值转型的重要标志以及实现人与自然和谐共处的必经之路。正因为如此，在其发展过程中应该注意以下几个问题。
3.1海绵城市的建设要以保护城市生态系统为前提
雨水降落到地表以后，经过截留、渗透、调蓄形成地表雨水径流，最后流入汇渠。其中，渗透过程和地表雨水径流管理是核心问题，其影响因素为地表植被土壤和地面坡度大小。在提出海绵城市建设理念之前，城市规划考虑更多的是用地功能，对于雨水主要考虑的是排泄，即地下管网基础设施建设，而对于路面建设等，则是人为地割裂了雨水与地下的天然联系。在城市开发过程当中不透水的硬质路面会导致径流系数增加＼[8、9＼]，通常情况下，林地的径流系数约为0.1～0.2，农田地的径流系数为0.5～0.6，城市的径流系数一般为0.9～1.0。因此，降水到达地表后难以下渗，形成了地表径流，造成了城市内涝。海绵城市就是克服了以往的不足，将雨水利用的几个基本功能综合起来进行考虑[10]。不过，在海绵城市建设过程中，对雨水的截留和调蓄设施是建设重点，在建设过程中，应充分尊重自然环境变化规律，最大限度地保护城市生态系统[11]。
3.2海绵城市建设应充分认识南北方自然环境差异
南北方城市建设差异较大，在进行海绵城市建设的过程当中，需结合城市的地理环境因素，具体情况具体分析。从宏观建设角度出发，南北方城市开发的着重点有所不同。对于北方城市来说，降雨量小，蒸发量大，如何存蓄更多的降水、并能及时地加以再利用是关键问题[10]。而南方城市因降雨量较大，河流、湖泊众多，排洪量远小于降水积蓄量，造成了地表径流，容易诱发城市内涝。因此，在进行海绵城市建设过程中应该因地制宜，选择合适的建设方案[12]。
3.3做好基础性研究和合理规划论证工作
对当地生态环境、城建分区应该注重基础性的研究和合理规划，这样才能使海绵城市建设具有系统性、基础性的准备，也会让海绵城市建设适应当地的自然环境和社会发展的需要。很多城市都将海绵城市的建设纳入城市基础设施建设的范畴之内，但是，如果海绵城市的规划不合理，将会导致城市功能区混乱，绿色海绵设施之间无法协调，丧失了海绵的“弹性”功能。如果对当地自然地理概况缺乏全面研究的话，更会使绿色海绵设施无法充分解决城市水体问题，严重的会使海绵城市建设徒劳一场。
4建议和对策
4.1大力提高城市的植被覆盖率
海绵城市的建设过程中，应大力提高城市的植被覆盖率。基本原则是城市生态建设和自然力的复原 ＼[8，11＼]。而传统的城市发展理念强调城市的经济职能和社会职能，以“坚固耐用、经济美观”为原则，忽视了城市水体涵养功能和生态环境的作用，在建设中偏离了正确的发展模式。例如，硬质的街道不利于雨水的下渗，不合理的沟渠开发，城市河道缩减，对湖泊等水体围填侵占等。因此，建设海绵城市就需要增加绿化面积，从环境保护入手，改善城市生态系统[15]。地表绿化是对降水的就地直接吸纳，这是发挥城市“海绵”功能的最重要的一步。海绵城市的建设不仅仅是一个工程问题，更是一个环境问题。从工程学的角度来看，工程手段可以提高对降水的利用率，而从城市生态环境保护的角度出发，才能从开发战略、指导思想上彻底转变思路，把海绵城市的建设当作永久性的，战略性的事业去发展＼[15、16＼]，总体来说就是要保证城市绿地的覆盖面积并使其得以有效保护，例如江苏省城区用地规划就充分考虑了这些特点。
4.2重视地理环境要素，将蓄水和雨水再利用作为重点针对南北方差异问题：在北方进行城市基础设施建设时，应将蓄水、降水再利用作为开发的重点。例如哈尔滨群力雨洪公园，就合理地解决了雨水的收集、调蓄、排泄，不仅合理利用了雨水资源，而且较好地解决了水污染问题。通过简单的挖方和填方，缓解低洼地积水问题，实现高地与低地相结合，高地种植旱生植被、低地建设鱼塘并种植喜湿植被，建设新颖的农业景观＼[17，18＼]，缓解雨洪压力。此外，公园四周建造大小不一的水坑，收集城市降水，经过自然汇集、过滤后在低洼地汇聚供给鱼类饲养，将多余降水转移到调蓄地区，尤其是城市污水，在向异地转移过程中实现过滤和汇集来解决城市水污染问题＼[18，19＼]，建立发达的地下管渠，实现蓄水地区与城市之间水体的自由调动。
对于南方城市建设而言，由于降水较多，应采用降水就地吸纳的方式，如贵州六盘水明湖湿地公园的建设理念就是典型代表，其核心是通过减缓城市排水速度来实现“海绵性”，传统的城市排水排洪工程主要以快速排水为主，而新型海绵城市的建设打破了这一束缚，明湖湿地公园位于市区内，通过恢复水城河两岸的植被减少地表径流，增加水体中的氧气含量。种植各种植物，促使富营养化的水体被生物吸收，缓解城市水体污染，同时，建立梯田式湿地＼[20，21＼]，有效的减缓地表径流、削减洪峰、调节季节性降雨和城区空气质量＼[22，23＼]。
4.3加强海绵城市建设的基础性研究，完善相关政策
在海绵城市的建设之初，要对该城市自然地理概况做出分析，如城市地貌特征、降水量、地下水水情、地质概况等，这也是海绵城市建设的基础工作，具有海绵效应的城市绿色设施，如对绿色屋顶、冠层截流、绿色街道、生态沟、雨水花园、蓄水池等建设做到心中有数。
在保障措施上，首先要制定相关的规章，出台相应的指导意见，引导各地区建设符合本地区的具有可操作性的建设方案，并将海绵城市建设纳入法律体系，通过法律来保证海绵城市建设的落实和维护＼[15，24＼]。转变城市发展的观念，将城市发展和自然融为一体，划分合理的城市功能，实现城市建筑、排水、水利工程等多方面的衔接＼[25，26＼]。
5结语
本文主要阐述了海绵城市的概况、提出背景以及国内外发展现状。探讨在进行海绵城市建设过程当中应该注意的几个问问题，这些问题是不同角度、不同的发展阶段对海绵城市建设的基本要求。影响海绵城市发展的问题主要为自然环境因素，明确自然环境与基础设施建设之间的相互关系，可以促进海绵城市的发展，实现人与自然的和谐共处。
参考文献：
[1]陈献， 尤庆国， 张瑞美，等. 试论我国城市雨洪资源综合利用[J]. 水利发展研究，2016（3）：3～7.
[2]鞠茂森. 关于海绵城市建设理念、技术和政策问题的思考[J]. 水利发展研究，2015（3）：7～10.
[3]吴丹洁. 中国特色海绵城市的新兴趋势与实践研究[J]. 中国软科学，2016（1）： 79～97.
【关键词】 海绵城市 给排水建设 注意问题
随着世界环境的逐渐恶化以及城市建设的需要，越来越多的城市开始建造海绵工程，提升城市应对雨水的能力，留住雨水资源，为城市供水做出贡献。但是，我国的海绵工程建设的能力还存在不足，建设过程中存在的问题较多，为此，本文结合笔者的工作经验，阐述海绵城市给排水建设中需要注意的问题和相应的建议，以期为我国的城市建设做出贡献。
1 海绵城市给排水建设的意义
1.1 提高环境适应能力
众所周知，我国土地面积广阔，既有较为干旱的西北地区，又包含雨水充足的沿海地区，同时，随着气候环境的不断变化，我国城市大多会经历雨水的考验，当雨水量较大时，城市的排水压力会比较大，大多数城市会出现内涝问题，为此必须要做好给排水建设工作，提升城市应对风险的能力。我国目前开始建设海绵工程，其主要的作用是提升环境适应能力，降低雨水的不良影响，保留雨水资源，利用防、排、蓄、渗、滞等方法，不但可以减少内涝问题的产生，同时还可以有效提高水资源利用效率[1]。
1.2 恢复受损害水体
海绵工程的作用不仅在于提升环境适应能力，其还能有效地恢复和净化受损的水体，在海绵工程中，通过利用专业的技术和自然途径，能够将自然水文特征维持在城市开发前状态，提高对城市原有生态系统的保护效率。海绵工程中的生态手段对粗放式城市建设环境进行优化，能够恢复前期受损坏的水体，使其能够降低污染程度，在海绵工程的给排水建设工作中，应当首先对城市的水体情况进行细致的检查，找出问题较为严重的区域，并集中加快海绵工程建设，提升水体的恢复速率，政府部门应当将海绵工程与其他的工程进行联合。
1.3 提高水资源利用率
由于客观环境的限制，我国大多数地区处于缺水的状态中，但是，我国城市建设正处在高速发展的阶段，对水资源的需求非常强烈，如果仅靠地下水源，很难满足发展的需要，为此，我国城市需要更多的水资源供应渠道，保障城市建设顺利进行，其中，海绵工程能够有效地提升水资源的利用率，让水资源通过自然渗透、自然积存以及自然净化等过程，重新被人们所利用，从而降低城市建设的成本，提高城市发展的速度。
2 海绵城市给排水建设存在的问题分析
2.1 依据科学性低
目前，我国在海绵城市的建设方面经验较少，发展的思路主要来源于少数的科研单位和政府部门，因此导致我国海绵城市的科学性较差，这也导致我国海绵城市在运营过程中出现诸多问题，水资源的利用效率并没有明显的提高。这说明，科学程度对海绵城市的建设尤为重要，每个城市在建设过程中，要结合自身城市的特点，做好给排水的规划和方案，掌握各项建设指标，尤其是要做好水量预测与水平衡分析。
2.2 排水体系不合理
虽然现如今我国城市的建设速度不断加快，但是，我国城市发展的时间较短，发展的经验相对不足，其中给排水建设工作一直为社会所诟病，例如我国大多数城市使用的雨水分流机制应用效率非常低，尤其是在西北地区，雨水管道长时间闲置，而且雨水资源往往是直接排放到目的区域，造成资源严重浪费。因此，我国的海绵城市应当避免上述问题，实现对雨水的分流储存，使得雨水资源得到有效的利用[2]。
2.3 给排水体系影响大
我国的城市建设者已经认识到地下设施建设的必要性，随着时代的发展，地下的构筑物数量逐渐增加，城市的给排水系统更加优化，但是其对城市的影响也随之增大，同时现有供水管道长度、 质量以及建设等方面均存在一定的不足，并不能完全满足城市建设需求。因此，在海绵城市的建设过程中，应当对给排水系统的规划设计进行优化，降低其建设对已存自然水体系的影响。
3 对海绵城市给排水建设提出的建议
3.1 基于具体情况进行给排水建设
我国土地面积广阔，这也导致我国城市的具体情况各不相同，为此，在海绵城市的建设过程中，应当结合自身的实际情况，避免盲目地学习其他城市的成熟经验，要做到因地制宜。例如济南海绵工程中，其主要的海绵道路分布在城市的南边，这是因为济南以“泉城”而闻名，其需要雨水作为补充，而且济南的南边地势较高，海绵工程中的水资源能够逐渐渗透到泉水聚集区，从而满足泉水喷涌的需要。
3.2 注重专业性技术方面的研究
海绵城市的给排水建设工作是城市基础设施建设的重要内容，为了提高建设的质量，相关单位应当加强专业性技术的研究，提升技术的科技水平，保证建设出的海绵工程具备较好的质量，使用更长的时间，尤其是在海绵城市的建设目前处于初级阶段，一定要一边建设一边摸索着前进，无论是相关政策还是施工经验均比较少，对系统设计提供的依据支持较低，因此具有很强的不确定性。
3.3 落实责任体系机制
海绵城市的建设过程比较漫长，而且我国在这方面的经验较为缺乏，在建设工作中，一定要将责任进行明确，落实责任体系机制，以现有的基础设施为对象，对其进行统筹分析、规划与设计，提高各类基础设施运行的安全性，且满足其与给排水系统协调运行的要求。
总之，海绵城市是未来一段时间内我国城市建设的主要方向，其中给排水工程是最为重要的建设内容，每个城市在建设工作中，要立足自身的实际，以城市自身发展基础为依据，统筹各项影响因素，提升海绵工程的技术水平，对其中的难点问题进行有针对性的分析。通过海绵工程的建设，提高雨水资源的利用效率，为城市的健康发展提供建设的基础。
参考文献：
论文摘要 廓清医疗损害民事责任的构成要件是研究医疗损害民事责任的前提和关键。而对于医疗损害，医疗机构一般应承担民事赔偿责任。但在一些特殊情况下，虽然患者有损害，却可以免除医疗机构的赔偿责任。
论文关键词 医疗损害民事责任 构成要件 免责事由 侵权责任法 医疗事故处理条例
廓清医疗损害民事责任的构成要件是进一步研究医疗损害民事责任的前提和关键。而在医疗损害民事责任中，免责事由作为一种责任限制的制度设计，对于合理分配责任风险，，维护医患双方的利益平衡，实现公平正义具有重要作用。
一、医疗损害民事责任的成要件
这里所谓的构成要件，是指构成侵权应当承担民事赔偿责任的必要条件，这些条件必须同时具备。《侵权责任法》第五十四条规定：“患者在诊疗活动中受到损害，医疗机构及其医务人员有过错的，由医疗机构承担赔偿责任。”据此，医疗损害民事责任构成要件可以概括如下：
1.患者损害事实的存在。民法上所指的损害，不仅包括物质上的损失，也包括精神上的损失，即“民事权益受到侵害”。作为医疗损害是指患者在医疗机构的诊疗护理过程中，因医疗机构及医务人员的行为而给患者所造成的利益减少的不良后果，具体表现为患者的死亡、残疾、增加病痛、延长治疗时间等并由此所造成的财产上的减损及患者和家属精神上的焦虑、忧愁、苦恼等实际损害。
值得一提的是，《医疗事故处理条例》第4条将医疗事故分为四级，其中作为兜底条款而对其他造成患者人身损害情形加以涵盖的第四级医疗事故界定为“造成患者明显人身损害的其他后果的”，对应《医疗事故处理条例》第49条“不属于医疗事故的，医疗机构不承担赔偿责任”的规定，显然该规定显得过于苛刻。因为我国《民法通则》规定，只要行为人的过错造成他人的人身损害，就需要承担民事责任，并未限定这种伤害必须是“明显”；此外，有时患者遭受了死亡、残疾以及器官组织损伤导致功能障碍之外的其他人身损害的，虽然此种损害非常严重但需经过一定的时间才能显现出来，而依《医疗事故处理条例》却可能构不成医疗事故从而得不到相应赔偿。而《侵权责任法》将其修正为只要“患者在诊疗活动中受到损害”，在医疗机构及其医务人员有过错的前提下，医疗机构就将承担赔偿责任。很明显，《侵权责任法》的规定对患者而言更加合理而人性化。
2.医疗机构及其医务人员有过错。这也是医疗主体承担医疗损害责任的归责原则和最终要件。法律概念里的过错包括故意和过失两种形式，但在医疗损害民事责任中，医疗机构及医务人员的过错只有过失一种形式，即在医疗损害民事责任中，患者的损害事实只能是由医疗机构及医务人员的过失造成的。因为如果医疗机构及医务人员由于主观故意造成患者损害后果的，就构成了故意伤害或故意杀人，属于刑事责任，应由《刑法》来调整，当不在医疗损害民事责任的范畴内。医疗损害中的过失，包括疏忽大意的过失和过于自信的过失两种。对于医疗机构及医务人员主观上是否有过失应以其所应尽的注意义务为标准，同时也要综合考虑医疗环境、医疗尝试及医学的发展现况。
在医患关系中由于双方所处地位关系的特殊性，医疗机构及医务人员主观上是否存在过错适用举证责任倒置原则。同时《侵权责任法》又明确加以规定“因下列情形之一的，推定医疗机构有过错：（一）违反法律、行政法规、规章以及其他有关诊疗规范的规定；（二）隐匿或者拒绝提供与纠纷有关的病历资料；（三）伪造、篡改或者销毁病历资料。”
3.患者的损害事实与医疗机构及医务人员的过错之间具有因果关系。医疗损害必须与医疗行为之间存在必然的因果关系，否则医疗行为便不存在损害事实。因果关系是确定医疗损害民事责任的必要条件之一，如果患者的损害事实与医疗机构及医务人员的主观过错间没有因果关系，那么医疗机构及医务人员就不承担民事赔偿责任。
需要说明的是，这里的因果关系并非仅限定于直接因果关系。因为如果依直接因果关系的要求，如果医疗机构及医务人员的行为是患者受损害的间接原因时，医疗机构就无需承担责任。这显然是有失公平的。因为尽管间接原因只是对结果的发生具有某种可能性，但其本身仍然属于造成结果发生的原因之一，并非完全没有关联，况且直接原因与间接原因在一定条件与环境下还可以相互转化。事实上，因果关系中既存在一因一果的的简单情形，更大量存在一因多果、多因一果或多因多果等复杂情形。医疗损害本身就是患者自身体质、医学技术水平、医疗机构及医务人员的行为、法律的适用等多项复杂因素交错其中的问题，简单地依据原因力去区分所谓的直接原因与间接原因很难做到。因此，只要医疗机构及医务人员的过失行为与患者的损害结果之间有因果关系存在，就应依法承担相应的民事责任。
一般而言，在医疗损害诉讼中，要证明患者在医疗过程中死亡、残疾及其他损害后果较为容易，但要证明患者所受的损害后果是医疗机构及医务人员的医疗诊治行为所致，即二者存在因果关系，对于一般患者而言，很难以证据证明。因此同是否具有医疗过错举证责任一样，对其也采取举证责任倒置原则，即由医疗机构证明其医疗行为与患者人身损害之间不存在因果关系。如医疗机构举证不能就应认定二者具有因果关系，医疗机构应承担损害赔偿责任。对此，最高人民法院2001年12月公布的《最高人民法院关于民事诉讼证据的若干规定》第4条明确规定：“因医疗行为引起的侵权诉讼，由医疗机构就医疗行为与损害后果之间不存在因果关系及不存在医疗过错承担举证责任。”
二、医疗损害民事责任的免责事由
对于医疗损害，医疗机构一般应承担民事赔偿责任。但在一些特殊情况下，虽然患者有损害，医疗机构却可以免责。对此，《侵权责任法》和《医疗事故处理条例》都作出了相应规定。《侵权责任法》第60条明确规定：“患者有损害，因下列情形之一的，医疗机构不承担赔偿责任：（一）患者或者其近亲属不配合医疗机构进行符合诊疗规范的诊疗；（二）医务人员在抢救生命垂危的患者等紧急情况下已经尽到合理诊疗义务；（三）限于当时的医疗水平难以诊疗。前款第一项情形中，医疗机构及其医务人员也有过错的，应当承担相应的赔偿责任。”《侵权责任法》在这里提到了三种情形下医疗损害民事责任的免责事由。笔者认为除此之外，《医疗事故处理条例》第33条所规定的的六种不属于医疗事故的情形，在一定条件下仍然可以作为医疗损害民事责任的免责事由。事实上，《侵权责任法》第60条就是对《医疗事故处理条例》第33条的第（五）、第（一）及第（三）项的进一步完善。此外，依据相关法律法规，在特定情况下仍不乏医疗损害民事责任的免责事由。在此，笔者一并作如下论述：
1.患者或者其近亲属不配合医疗机构进行符合诊疗规范的诊疗从而导致患者损害的医疗机构免责。患者到医疗机构就医是患者的权利，同样患者就医后，配合医疗机构进行符合诊疗规范的、必要的医学常规检查及诊治等诊疗活动是患者及其近亲属的义务，这样做的目的最终也符合患者的诊疗利益。但是，如果是由于患者及其近亲属的不予配合而延误诊疗导致不良后果的，则患者的不良后果与医疗机构及其医务人员的行为之间没有因果关系，医疗机构对此损害不应承担赔偿责任。这里所谓患者及其近亲属的不予配合是指其主观上具有过错，具体表现为故意或过失行为。当然如果医疗机构及其医务人员对这种不良后果的发生也有过错的，则不能完全免除医疗机构的赔偿责任，而只能适当减轻赔偿责任。此时应依医疗机构及医务人员在不良后果的产生中所起的作用（原因力的大小）来确定其相应的赔偿责任。
2.医务人员在抢救生命垂危的患者等紧急情况下已经尽到合理诊疗义务的医疗机构免责。对生命垂危急需抢救的患者而言，“时间就是生命”。这里所谓的“紧急情况”必须具备两个构成要件：其一是必须情况紧急，患者存在生命危险，这种危险迫在眉睫；其二是此时的紧急医疗措施应当是限于迫不得已，即当时没有任何其它更好的救助措施可以实施，医疗机构及其医务人员已经尽到合理诊疗义务。反之，如果在救助的时候，明显存在对患者来说可能更好的救助措施和方法，而医务人员却采用了给患者造成损害的医疗措施，即对这种损害的造成具有故意或重大过失，则医疗机构当然应对患者的损害后果承担相应的责任。
3.限于当时的医疗水平难以诊疗的医疗机构免责。即在当时医学科学技术条件下，发生无法预料或者不能防范的不良后果。从理论上讲，医学科学技术水平的发展是永远滞后于医疗实际需要的。因此，在医疗活动中，由于受科学技术发展水平的限制，可能会发生无法预料或不能防范的不良后果，如并发症、副作用等。这些不良后果是医疗机构及其医务人员在主观上无法预料的，即使预料到了也不能预防，既主观上无过失。
4.在医疗活动中，由于患者病情异常或者患者体质特殊而发生医疗意外的医疗机构免责。因患者病情异常或者患者体质特殊而发生了不良后果，是否免除医疗机构的责任，不能一概而论。所谓构成医疗意外的，是指这种不良后果必须是医务人员难以预料和防范的，即医务人员已尽到注意义务仍不能避免发生损害后果的才能免除责任。而如果医务人员明知患者具有特殊体质却于治疗中不加预防而导致不良后果的，则不能免除医疗机构的责任，既不构成医疗意外。
论文关键词 医疗损害民事责任 构成要件 免责事由 侵权责任法 医疗事故处理条例
廓清医疗损害民事责任的构成要件是进一步研究医疗损害民事责任的前提和关键。而在医疗损害民事责任中,免责事由作为一种责任限制的制度设计,对于合理分配责任风险,,维护医患双方的利益平衡,实现公平正义具有重要作用。
一、医疗损害民事责任的成要件
这里所谓的构成要件,是指构成侵权应当承担民事赔偿责任的必要条件,这些条件必须同时具备。《侵权责任法》第五十四条规定:“患者在诊疗活动中受到损害,医疗机构及其医务人员有过错的,由医疗机构承担赔偿责任。”据此,医疗损害民事责任构成要件可以概括如下:
1.患者损害事实的存在。民法上所指的损害,不仅包括物质上的损失,也包括精神上的损失,即“民事权益受到侵害”。作为医疗损害是指患者在医疗机构的诊疗护理过程中,因医疗机构及医务人员的行为而给患者所造成的利益减少的不良后果,具体表现为患者的死亡、残疾、增加病痛、延长治疗时间等并由此所造成的财产上的减损及患者和家属精神上的焦虑、忧愁、苦恼等实际损害。
值得一提的是,《医疗事故处理条例》第4条将医疗事故分为四级,其中作为兜底条款而对其他造成患者人身损害情形加以涵盖的第四级医疗事故界定为“造成患者明显人身损害的其他后果的”,对应《医疗事故处理条例》第49条“不属于医疗事故的,医疗机构不承担赔偿责任”的规定,显然该规定显得过于苛刻。因为我国《民法通则》规定,只要行为人的过错造成他人的人身损害,就需要承担民事责任,并未限定这种伤害必须是“明显”;此外,有时患者遭受了死亡、残疾以及器官组织损伤导致功能障碍之外的其他人身损害的,虽然此种损害非常严重但需经过一定的时间才能显现出来,而依《医疗事故处理条例》却可能构不成医疗事故从而得不到相应赔偿。而《侵权责任法》将其修正为只要“患者在诊疗活动中受到损害”,在医疗机构及其医务人员有过错的前提下,医疗机构就将承担赔偿责任。很明显,《侵权责任法》的规定对患者而言更加合理而人性化。
2.医疗机构及其医务人员有过错。这也是医疗主体承担医疗损害责任的归责原则和最终要件。法律概念里的过错包括故意和过失两种形式,但在医疗损害民事责任中,医疗机构及医务人员的过错只有过失一种形式,即在医疗损害民事责任中,患者的损害事实只能是由医疗机构及医务人员的过失造成的。因为如果医疗机构及医务人员由于主观故意造成患者损害后果的,就构成了故意伤害或故意杀人,属于刑事责任,应由《刑法》来调整,当不在医疗损害民事责任的范畴内。医疗损害中的过失,包括疏忽大意的过失和过于自信的过失两种。对于医疗机构及医务人员主观上是否有过失应以其所应尽的注意义务为标准,同时也要综合考虑医疗环境、医疗尝试及医学的发展现况。
在医患关系中由于双方所处地位关系的特殊性,医疗机构及医务人员主观上是否存在过错适用举证责任倒置原则。同时《侵权责任法》又明确加以规定“因下列情形之一的,推定医疗机构有过错:(一)违反法律、行政法规、规章以及其他有关诊疗规范的规定;(二)隐匿或者拒绝提供与纠纷有关的病历资料;(三)伪造、篡改或者销毁病历资料。”
3.患者的损害事实与医疗机构及医务人员的过错之间具有因果关系。医疗损害必须与医疗行为之间存在必然的因果关系,否则医疗行为便不存在损害事实。因果关系是确定医疗损害民事责任的必要条件之一,如果患者的损害事实与医疗机构及医务人员的主观过错间没有因果关系,那么医疗机构及医务人员就不承担民事赔偿责任。
需要说明的是,这里的因果关系并非仅限定于直接因果关系。因为如果依直接因果关系的要求,如果医疗机构及医务人员的行为是患者受损害的间接原因时,医疗机构就无需承担责任。这显然是有失公平的。因为尽管间接原因只是对结果的发生具有某种可能性,但其本身仍然属于造成结果发生的原因之一,并非完全没有关联,况且直接原因与间接原因在一定条件与环境下还可以相互转化。事实上,因果关系中既存在一因一果的的简单情形,更大量存在一因多果、多因一果或多因多果等复杂情形。医疗损害本身就是患者自身体质、医学技术水平、医疗机构及医务人员的行为、法律的适用等多项复杂因素交错其中的问题,简单地依据原因力去区分所谓的直接原因与间接原因很难做到。因此,只要医疗机构及医务人员的过失行为与患者的损害结果之间有因果关系存在,就应依法承担相应的民事责任。
一般而言,在医疗损害诉讼中,要证明患者在医疗过程中死亡、残疾及其他损害后果较为容易,但要证明患者所受的损害后果是医疗机构及医务人员的医疗诊治行为所致,即二者存在因果关系,对于一般患者而言,很难以证据证明。因此同是否具有医疗过错举证责任一样,对其也采取举证责任倒置原则,即由医疗机构证明其医疗行为与患者人身损害之间不存在因果关系。如医疗机构举证不能就应认定二者具有因果关系,医疗机构应承担损害赔偿责任。对此,最高人民法院2001年12月公布的《最高人民法院关于民事诉讼证据的若干规定》第4条明确规定:“因医疗行为引起的侵权诉讼,由医疗机构就医疗行为与损害后果之间不存在因果关系及不存在医疗过错承担举证责任。”
二、医疗损害民事责任的免责事由
对于医疗损害,医疗机构一般应承担民事赔偿责任。但在一些特殊情况下,虽然患者有损害,医疗机构却可以免责。对此,《侵权责任法》和《医疗事故处理条例》都作出了相应规定。《侵权责任法》第60条明确规定:“患者有损害,因下列情形之一的,医疗机构不承担赔偿责任:(一)患者或者其近亲属不配合医疗机构进行符合诊疗规范的诊疗;(二)医务人员在抢救生命垂危的患者等紧急情况下已经尽到合理诊疗义务;(三)限于当时的医疗水平难以诊疗。前款第一项情形中,医疗机构及其医务人员也有过错的,应当承担相应的赔偿责任。”《侵权责任法》在这里提到了三种情形下医疗损害民事责任的免责事由。笔者认为除此之外,《医疗事故处理条例》第33条所规定的的六种不属于医疗事故的情形,在一定条件下仍然可以作为医疗损害民事责任的免责事由。事实上,《侵权责任法》第60条就是对《医疗事故处理条例》第33条的第(五)、第(一)及第(三)项的进一步完善。此外,依据相关法律法规,在特定情况下仍不乏医疗损害民事责任的免责事由。在此,笔者一并作如下论述:
1.患者或者其近亲属不配合医疗机构进行符合诊疗规范的诊疗从而导致患者损害的医疗机构免责。患者到医疗机构就医是患者的权利,同样患者就医后,配合医疗机构进行符合诊疗规范的、必要的医学常规检查及诊治等诊疗活动是患者及其近亲属的义务,这样做的目的最终也符合患者的诊疗利益。但是,如果是由于患者及其近亲属的不予配合而延误诊疗导致不良后果的,则患者的不良后果与医疗机构及其医务人员的行为之间没有因果关系,医疗机构对此损害不应承担赔偿责任。这里所谓患者及其近亲属的不予配合是指其主观上具有过错,具体表现为故意或过失行为。当然如果医疗机构及其医务人员对这种不良后果的发生也有过错的,则不能完全免除医疗机构的赔偿责任,而只能适当减轻赔偿责任。此时应依医疗机构及医务人员在不良后果的产生中所起的作用(原因力的大小)来确定其相应的赔偿责任。
2.医务人员在抢救生命垂危的患者等紧急情况下已经尽到合理诊疗义务的医疗机构免责。对生命垂危急需抢救的患者而言,“时间就是生命”。这里所谓的“紧急情况”必须具备两个构成要件:其一是必须情况紧急,患者存在生命危险,这种危险迫在眉睫;其二是此时的紧急医疗措施应当是限于迫不得已,即当时没有任何其它更好的救助措施可以实施,医疗机构及其医务人员已经尽到合理诊疗义务。反之,如果在救助的时候,明显存在对患者来说可能更好的救助措施和方法,而医务人员却采用了给患者造成损害的医疗措施,即对这种损害的造成具有故意或重大过失,则医疗机构当然应对患者的损害后果承担相应的责任。
3.限于当时的医疗水平难以诊疗的医疗机构免责。即在当时医学科学技术条件下,发生无法预料或者不能防范的不良后果。从理论上讲,医学科学技术水平的发展是永远滞后于医疗实际需要的。因此,在医疗活动中,由于受科学技术发展水平的限制,可能会发生无法预料或不能防范的不良后果,如并发症、副作用等。这些不良后果是医疗机构及其医务人员在主观上无法预料的,即使预料到了也不能预防,既主观上无过失。
4.在医疗活动中,由于患者病情异常或者患者体质特殊而发生医疗意外的医疗机构免责。因患者病情异常或者患者体质特殊而发生了不良后果,是否免除医疗机构的责任,不能一概而论。所谓构成医疗意外的,是指这种不良后果必须是医务人员难以预料和防范的,即医务人员已尽到注意义务仍不能避免发生损害后果的才能免除责任。而如果医务人员明知患者具有特殊体质却于治疗中不加预防而导致不良后果的,则不能免除医疗机构的责任,既不构成医疗意外。
论文关键词：北京私家园林,海绵城市,理水,风景园林
经实地考察与历史资料汇总，总结了北京西郊八处私家园林的历史演变和水系的景观结构。
1.1 北京市西郊私家园林历史演变
承泽园，始建于雍正三年（1725），没落于（1911），为清果亲王允礼的园林；蔚秀园，始建时间不详，最早记为载为道光十六年（1836），没落于咸丰十年（I860），为清定郡王载铨的园林；淑春园，始建时间不详，最早记载为康熙二十六年（1687），没落于咸丰十年（1860），为清大臣和珅的宅园；鸣鹤园，始建时间不详，最早记载为嘉庆七年（1802），于咸丰十年（1860）没落，是清惠亲王愉的宅园；镜春园，始建时间不详，最早记载为嘉庆七年（1802），于咸丰十年（1860）没落，属清庄静公主；朗润园，始建时间不详，最早记载为嘉庆年间（1795）民国初年（1912）改建，属清庆郡王瑶；勺园，始建于万历40年（1612）至42年（1614）年间，咸牟十年（1860）没落，属明官员米万钟；治贝子园，始建时间不详，最早记载为光绪中叶（1871-1908），宣统八年（1916）没落，属淸贝子载治。
1.2 北京市西郊私家园林水系结构
承泽园在昆明湖二龙闸出水口和万泉河的汇合之处，园内从西向东有两条河纵贯全园。蔚秀园从南引万泉河水入园，全园湖面约十余处，大小形状各不相同，形成回环水系。淑春园属原永定河的古河道，以“水”为脉，全园都分局着分散的水面，水景变化多端。鸣鹤园的水面富于变化，东侧较规则有序，西侧相较更为自由活泼，显示了传统园林的多层次变化。镜春园建筑位于中央，四周湖水围绕，全园观景以静观为主，动观辅之。朗润园布局则为曲水和土山环绕全园，中心形成一岛，建筑集中修剪于岛上，四面临水。勺园景观以水景为主，水面或堤桥分隔，或环水而筑，形成许多不同水景空间。治贝子园设置辘车卢转井，通过这种工程向石槽注水，形成“曲水流觞”之美景。
2 北京市西郊私家园林的理水艺术
杨鸿勋先生在《江南园林论》中总结传统园林理水艺术，有池塘、湖泊、溪流、江河、濠濮、泉水等类型[1]。北京私家园林的水景可归入以上类型之中。
2.1 池塘型水系
池塘型水系是简单的水池，多为长方形，显出人工气息和静谧氛围。如半亩园早先的方池，寸园内形如砚台的小池“砚沼”都是属于这一类型。再如鸣鹤园和蔚秀园中都设有独立的金鱼池。另外，许多的京城宅园的设计中常在庭院内设一“月牙河”，形状似弯月，如崇礼宅园、马家花园等。
2.2 湖泊型水系
湖泊型的水系在北京私园中也经常出现，其大小各不相等。但无论大小，其岸大多都是曲折蜿蜒，且多为叠石形成驳岸。湖泊型的水系经常做源头和尾流以及水湾等部位，同时在端头架设小桥，形成更丰富的层次，如可园、那家花园、莲园等。大湖当中还要设置岛屿、长堤、水滩，从而形成更为丰富的景深，小学德育论文如淑春园、鸣鹤园，都是富有自然流转之意的。同时，与中国自然地形的呼应，北京园林的水系流向也经常是以西北为源头，流向东南的。
2.3 溪流型水系
溪流即蜿蜒的较狭窄的河道，许多花园都用它绕假山、亭榭，增加趣味。如藏园东部就有溪流潺潺而下，再如意园内也有小溪曲折萦绕。清华园、达园均设长溪流经全园，以此彰显水脉漫长，源源不尽。
2.4 濠濮型水系
濠濮型的水系可概括为两侧山峦叠石夹一水的形态。京郊规模较大的私家园林，如勺园、清华园、自怡园、朗润园、蔚秀园等，拥有变化繁复的水景，可泛舟游览。园中之水与人工假山通常互相倚靠，相辅相成。山水的关系最常见的有两种，一种是山与水彼此独立，叠石位于水池的尽头，山体走势与水的流向垂直，并与主建筑遥遥相对，形成“远山”的效果，如张伯驹的似园。另一种是山水彼此平行展开，咫尺相望，似有无尽之感，如清代西郊清华园北部山池、 民国礼士胡同李家花园后院石池等[2]。
3 对海绵城市建设的启示
3.1 功能完善的水系统
小水系联合形成大水系，大水系之间再联合形成更大的水网。在整个体系中，每一个私家园林就像是组织，其中的各个水面就像是细胞，而三山五园地区就像是器官，整个城市就像是个体。细胞组成组织，组织形成器官，器官又组成人体。由此可见，要实现海绵城市，就要一步一步细化，将整个城市的“吸水”落实到每一个雨水花园细胞的“吸水”。完整的水网结构建立之后，还要求水体有完善的功能。城市的低洼地，可以学习古典园林，就近收集滞留雨水。同时人工修建的排水沟渠是地面上的排水系统，保证雨水就近排放。城外的自然大河可为城市提供充足的水源，与大海相连的，则可以调控整个城市的水量。在整个过程中，暗沟主要用于人口密集的区域，大多在雨洪排放的起始段设置，路边的排水沟渠相互勾连，引导雨水进入城内的排水河道。这些河道应具有较强的蓄水作用，足以抵御暴雨径流所带来的威胁。
3.2 富有诗意的景观
在中国传营造中，雨水基设施的功能、形式与文化相得益彰，是传统文化价值取向的表现[3]。北京西郊的私家园林，是园林，也是水网系统，担任着北京市水源地这一角色，其主要功能在于蓄水，大到城市当中的主要蓄水区，小到一个雨水花园的蓄水区，都可以在进行借鉴。在满足工程目的的同时，融入设计师的思考，使海绵城市上升一个层次，成为山水城市。同时不应盲目的挖湖堆山，大兴土木，违背园林的初衷。
4 总结
海绵城市建设，应先分析自然水文变化过程，通过对水系的完整规划整理，保证水系网络完整性和水体功能的完善度。在满足水域的面积，河网的密度的同时营造兼有游赏和调蓄雨洪双重功能的城市空间。城市园林绿地应在改善城市环境条件的同时形成富有诗意的绿地景观，构建山水城市特色人居环境。孟兆祯院士说，园林建设是“从来多古意，可以赋新诗。”[4]在海绵城市建设的背景下，我们应借鉴古代北京城市水系规划与建设的优秀经验，变管网排水系统为综合治理。增加水道、湿地的面积，恢复河网的生态功能。建设以水定城，注重景观，水与绿相互结合的海绵城市。
【参考文献】
[1]杨鸿勋.江南园林论[M].上海：上海人民出版社，1994.
近年来以芽袍衣壳蛋白为分子载体，通过芽袍表而展示技术将外源目的蛋白展示在重组枯草芽袍杆菌芽袍表而，制备具有生物活性的重组芽袍抗体和酶制剂已成为人们研究和关注的热点。芽袍的结构相当复杂，中心部位为核芯，含有原生质体，被芽袍膜包裹；核芯外而为皮层，成分为肚聚糖，再往外是一层或者数层蛋白质组成的芽袍壳，最表而为芽袍壁。B. subhfis芽袍中约包含25种衣壳蛋白，而本研究前期已利用CotC为载体成功将海藻糖合酶展示在芽袍表而。但是由于芽袍易受萌发剂刺激而萌发，当芽袍萌发时首先会释放2,6-毗咤一梭酸钙CCaz+-dipicolinicacid Caz+-DPA)和大量离子，然后袍子皮层内的肚聚糖被水解，皮层水解会逐渐补充袍子核内的水分，最后芽袍恢复酶活力，导致衣壳蛋白被降解脱落，而海藻糖合酶相应脱落后也会被一些蛋白酶类降解，因此不仅失去了固定化酶的目的，还降低了海藻糖合酶酶活，加大其回收难度。所以，弱化芽袍萌发，钝化芽袍对外界环境刺激的感知变得尤为重要。本研究选择枯草芽袍杆菌芽袍萌发中的两个关键皮层溶解酶基因cwlJ和、IeB基因作为敲除对象，实现抑制芽袍萌发的目的，构建芽袍表而稳定展示海藻糖合酶的工程菌，提高芽袍的稳定性和利用率，更加高效稳定的表而展示海藻糖合酶。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
含有海藻糖合酶基因的枯草芽袍杆菌168(以下简称B. subtifis 168-Tres):本实验室保藏；含有卡那霉素抗性基因的质柳PIC9研口含有博来霉素抗性基因的质粒pPICZaA:杭州宝赛生物科技有限公司；限制性内切酶:日本TakaRa宝生物公司；卡那霉素、博来霉素、Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒:上海生工生物工程有限公司；高纯度质粒小量快速提取试剂盒:艾德莱生物公司；其他试剂均属于国产分析纯。实验所涉及引物见表1所示。
LB培养基:酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L,氯化钠10 g/L,pH 7.0-7.4 。
发酵培养基:葡萄糖10 g/L、玉米浆10 g/L,酵4浸粉3 g/L, NaCI 6 g/L, K2HP04 3 g/L, MnS04 0.3 g/L, MgS042.4 g/L, pH7.0-7.4 。
菌体增殖培养基:酵母浸粉5 g/L、蛋白陈10 g/L,氯化钠10 g/L、山梨醇91 g/L o
电转缓冲液:甘露醇91 g/L、山梨醇91 g/L、甘油100 g/10
菌体复苏培养基:酵母浸粉5 g/L、蛋白陈10 g/L,氯化钠10 g/L、甘露醇69 g/L、山梨醇91 g/L。
葡萄糖需在高压蒸汽灭菌锅中115℃灭菌20 min其他培养基均121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW – CJ - 2FD型双人单而净化工作台:苏州净化设备有限公司；WFJ 7200型可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司；5 804 R型离心机:德国Eppendorf公司；438℃型电转仪:德国Eppendorf公司；GNP - 9080型隔水式恒温培养箱:上海精宏实验设备有限公司；梯度PCR仪:美国应用生物系统公司；MD2000核酸超微量分光光度计:美国BioFuture公司；ZQYZ - CS型恒温振荡培养箱:上海知楚仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1重组同源性片段sleBl-kmr, cwIJ1-zeor的制备
用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取B. subtilis168-Tres菌体的脱氧核糖核酸(deoxyribose nucleic acidDNA)，并以此为模板，sleB F1和sleB R1为引物进行聚合酶链反应(polymerise chain reaction PCR)扩增，获得长度为592 bp用于敲除sleB基因的同源臂sleBl；使用高纯度质粒小量快速提取试剂盒提取pPIC9k质粒，以此为模板，sleB F2和sleB R2为引物进行PCR扩增，获得长度为1 502 bp的卡那霉素抗性基因片段km`；使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒胶回收所得的sleB 1片段与kmr片段为模板，sleB F1和sleB R2为引物进行重叠延伸PCR， PCR扩增条件为:（1）95 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 sec, 57 ℃退火30s，72℃延伸3.5 min， 5个循环；72 ℃延伸2 min； （2） 95 ℃预变性5 min94 ℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸4.5 min, 30个循环；72℃延伸10 min ， 4℃保存，扩增得到长度为2 094 bp的同源重组片段sleBl -kmr，并使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收，保存于-20℃备用。cwlJl长度为451 bp博来霉素抗性基因片段为1 205 bp，cwlJl-zeor片段制备方法同上。Bacillus subtifis 168-TresOsleBΔcwIJ工程菌构建流程见图1。
1.3.2 回收产物的酶切及浓缩
用限制性内切酶BamH I酶切sleB 1-kmr和 cwLll -zeor基因片段，并向酶切产物中加入1/10体积3 mol/L醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，置于-20℃冰箱冷却20 min，然后12 000 r/min离心5 min得沉淀；加入300 μL体积分数为75%乙醇重悬沉淀，12 000 r/min离心5 min后除去乙醇,37℃风干30 min最后加入15-20 μLddHZO重悬DNA。使用核酸超微量分光光度计测定回收DNA质量浓度，并最终获得质量浓度在200-500 ng/μL之间的DNA溶液。
1.3.3 电转感受态细胞的制备
挑取新鲜LB固体培养基表而的B. subtifis 168-Tres单菌落，接种于10 mL菌体增殖培养基中，37 ℃,220 r/min培养12h；将上述菌液转接到50 mL菌体增殖培养基中至菌液初始OD600mm = 0.2，然后37 ℃,220 r/min培养菌体至OD600mm = 1.0；将菌液转移到100 mL离心管，冰浴10--15 min后，4 ℃ ,8 000 r/min离心5 min，收集菌体；离心后的菌体用预冷的电转缓冲液洗涤2--3次，并使用1 mL电转缓冲液重悬菌体，制成枯草芽袍杆菌电转化感受态[mo；将制备好的感受态细胞每管分装100 μL，-80℃保存备用。B. subtilis 168-TresasleB感受态的制备方法同上。
1.3.4 电转化
将回收片段sleBl-kmr与B. subtifis 168-Tres感受态混合均匀，然后加到2 mm电转杯中预冷5 min，并使用电转仪在2 000 V,5 ms条件下电转化，电转完成后立即加入500 μL菌体复苏培养基，37 ℃,180 r/min复苏培养3h后涂布在含卡那霉素(25 μg/mL)的LB 固体培养基中，于3 7 ℃恒温培养箱中培养1-2 d，筛选出抗卡那霉素的菌株。将cwlJl-zeor与B. subtifis 168-TresΔsleB感受态电转后，筛选出抗卡那霉素和博来霉素的菌株。
1.3.5 阳性重组菌株的鉴定及传代培养
挑取阳性转化子接种到含卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃培养过夜后8 000 r/min离心并收集菌体，提取重组菌DNA，并以获得的基因组为模板，sleB FZ和sleB凡为引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，获得阳性重组菌株B. subtilis 168-TresΔsleBo重组菌B. subtilis168-TresΔsleBΔcwIJ的获得方法同上。用LB液体培养基将B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在3 7 ℃ , 200 r/min的培养条件下传代15次，做菌落PCR验证。
1.3.6 B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌芽抱形成检测
将原始菌株B. subtilis 168-Tre对口重组菌株B. subtilis168-TresΔsleBΔcwIJ以1%的接种量分别接种在发酵培养基中，置于37 ℃ , 200 r/min的恒温振荡培养箱中培养48 h,每隔4h取样，同时利用芽袍染色法对芽袍染色，置油镜观察，芽袍呈绿色，菌体成红色。观察10个视野的营养细菌与芽袍数，产芽袍率=芽袍数/(芽袍数+营养细胞数)x100%。
1.3.7 B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在LB培养基中芽抱萌发验证
分别将发酵48 h后的重组菌与原始菌菌液80℃水浴20 min，立即冰浴，将菌体稀释后涂布在LB固体培养基中，放置在37 ℃'恒温培养箱中培养30 h，用平板计数法记录芽袍萌发结果。
1.3.8 B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在麦芽糖转化体系中芽抱萌发验证
分别取5 mL发酵48 h后的重组菌与原始菌菌液80 ℃水浴20 min，立即冰浴，与10 mL pH 7.5的磷酸盐缓冲液配制的终浓度30%的麦芽糖浆混匀后制备成海藻糖合酶的反应体系。将此反应体系置于25 ℃恒温水浴振荡摇床中反应12h，每隔4h取样涂布在LB培养基中，放置在37℃恒温培养箱中培养30 h，用平板计数法记录芽袍萌发结果。
1.3.9 B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在麦芽糖转化体系中海藻糖合酶酶活检测
分别将发酵48 h后的重组菌与原始菌发酵液8 000 r/min离心20 min，弃上清，用去离子水洗涤沉淀2次后并悬浮，加入溶菌酶使其终质量浓度为2 mg/mL后T-37℃放置30 min破坏营养细胞，后经8 000 r/min离心10 min，烘干，称量干菌体质量，最后用去离子水悬浮制得芽袍悬浮液，将5 mL芽袍悬浮液与10 mL pH 7.5的磷酸盐缓冲液配制的终浓度为30%的麦芽糖浆混匀，制备成海藻糖合酶的反应体系。将此反应体系置于25 ℃'恒温水浴振荡摇床中反应12h后，室温，1 000 r/min离心10 min取上清进行高效液相色谱Chigh performance liquid chromatography HPLC)检测转化体系中海藻糖。
HPLC测定色谱条件:Hypersil NHZ色谱柱(300 mmx4.6 mm 、5 μm)；流动相(乙睛冰=3:1，V/功；流速1.0 mL/min；示差折光检测器:波}}589.3nm；进样量10 μL；柱温:40℃。
海藻糖合酶活力定义:在25 ℃ , pH 7.5条件下，每分钟生成1 μmol海藻糖所需的酶量为一个酶活单位(U)。
2结果与分析
2.1基因敲除片段sleB 1-kmrb勺构建、电转化及鉴定
以B. subtilis 168-Tres菌体的基因组为模板，sleB F,和sleB R,为引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2a。由图2a可知，在600 bp左右出现特异性条带，与理论长度5 92 bp相符，表明已成功获得同源臂sleBl；以质粒pPIC9k为模板，sleB F2和sleB R2为引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2b。由图2b可知，在1 500 bp左右出现特异性条带，与理论长度1 502 bp相符，表明成功获得卡那霉素抗性基因片段kmr；以胶回收制得的sleBl片段与kmr片段为模板，sleB F,和sleB R2为引物进行重叠延伸PCR，得基因敲除片段sleBl-kmr, 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图2c。由图2c可知，在2 000 bp左右出现特异性条带，与理论长度2 094 bp相符，表明基因敲除片段sleBl -kmr构建成功。
通过乙醇沉淀法浓缩酶切片段后，测得DNA质量浓度为395.63 ng/μL。将10 μL回收片段与100 N.,L B. subtifis168-Tres感受态细胞混合并电转，用引物sleB F2和sleB R2对含卡那霉素平板上生长的菌落基因组进行验证，结果如图2d所示，表明sleBl-kmr与sleB发生同源重组，完成sleB基因的敲除，获得B. subtifis 168-TresΔsleB重组菌。
2.2基因敲除片段cwlJl-zeor的构建、电转化及鉴定
以B. subtilis 168-Tres菌体的基因组为模板，cw1J F1和cw1J R1为引物进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3a。由图3a可知，在500 bp左右出现特异性条带，与理论长451 bp相符，表明已成功获得同源臂cwlJl；以质粒pPICZaA为模板，使用引物cw1J F2和cw1J R2进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图3b。由图3b可知，在1200 bp左右出现特异性条带，与理论长度1 205 bp相符，表明成功获得博来霉素抗性基因片段zeor；以胶回收制得的cwlJl片段和zeor片段为模板，cw1J F1和cw1J R2为引物进行重叠延伸PCR，得基因敲除片段cwlJl-zeor, 1%琼脂糖凝胶电泳检验结果见图3c。由图3c可知，PCR产物，发现在1 700 bp左右出现特异性条带，与理论长度1 656 bp相符，表明基因敲除片段cwlJl-zeor构建成功。
通过乙醇沉淀法浓缩酶切片段后，测得DNA质量浓度为378.26 ng/μL。将10 μL回收片段与100 N.,L B. subtilis168-TresasleB感受态细胞混合并电转，用引物cw1J F2和cw1J凡对含km和zeo平板上生长的菌落基因组进行验证，结果如图3d所示，表明cwLll-zeor与cwlJ发生同源重组，完成cwlJ纂因的敲除，获得B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌。
2.3 B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌传代培养验证结果
B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌第5,10,15次传代后的菌落PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图40由图4可知，第5,10,15次传代在1 500 bp和1 200 bp都有条带产生，与Icm和zeor的理论值相符，表明重组菌的遗传稳定性并未发生变化。
2.4 sleB, cwlJ基因双敲除后对芽袍形成的影响
通过显微镜计数法计算原始菌株B. subtilis 168-Tres与重组菌B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ芽袍率，结果见图5.由图5可知，重组菌株比原始菌株生长迟缓约4 h,但两株菌在48 h后的芽袍形成率都约为88%，证明敲除sleB和cwlJ基因后会使菌体生长时间延迟，但芽袍形成率未发生变化。
2.5 B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在LB培养基中芽袍萌发验证
通过平板计数法对原始菌株和重组菌株芽袍萌况进行比较，结果见图6。由图6可知，B. subtifis 168-Tres芽袍萌发数为4.9x10 CFU/mL, B. subtifis 168-TresΔsleB芽袍萌发数为5.3 x104 CFU/mL, B. subtilis 168-TresΔcwlJ芽袍萌发数为2.1x107 CFU/mL, B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ芽袍未见萌发。
2.6 B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在麦芽糖转化体系中芽袍萌发验证
通过平板计数法对原始菌株B. subtifis 168-Tres和重组菌株B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ在麦芽糖转化体系中的芽袍萌况进行比较，结果见图7。由图7可知，原始菌株在麦芽糖转化体系中转化4h,8h,12h,16h后的芽袍萌发数都为4.8x108CFU/mL左右，而重组菌株芽袍在各个时段一直未见萌发。
2.7 B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌在麦芽糖转化体系中海藻糖合酶酶活检测
为了证实B. subtifis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌海藻糖合酶酶活是否有所提高，利用HPLC对重组菌芽袍悬浮液进行海藻糖合酶检测，结果见图8。由图8可知，用B. subtifis168-Tres原始菌芽袍转化测得的海藻糖合酶酶活为5.83 U}用B. subtilis 168-TresΔsleBΔcwIJ重组菌芽袍转化测得的海藻糖合酶酶活为10.42 U}重组菌比原始菌酶活提高了78.7%，这表明敲除、IeB和cwlJ基因后弱化了芽袍萌发，成功提高了芽袍表而展示海藻糖合酶的稳定性。
3 结论
