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序论：在您撰写基因工程载体的种类时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
[关键词]基因工程疫苗 核酸疫苗 免疫
[中图分类号]Q789-01 [文献标识码]A [文章编号]1009-5349（2014）11-0081-01
自Edward Jenne医生发明天花疫苗开始，已有几千种疫苗被开发出来，疫苗逐渐成为人类与疾病做斗争的重要武器之一。传统疫苗具有生产的成本高、疫苗中含强毒性致病物质、减毒株突变及部分疾病用传统的疫苗防治收效甚微等缺点。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。
DNA重组技术为新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法。基因工程疫苗是指应用DNA重组技术，通过基因组改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，进而达到防治传染病的目的。迄今为止，基因工程疫苗是最先进的疫苗，相比传统疫苗而言它有巨大的优势。
一、基因工程疫苗种类
应用基因工程技术开发的已经使用和正在研制的新型疫苗种类主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物可食疫苗等。
（一）基因工程亚单位疫苗
该类疫苗仅包含病原体的抗原，不包含病原体的其他遗传信息。基因工程亚单位疫苗通过表达病毒的主要保护性抗原蛋白获得免疫原性，具有安全、便于规模化生产等优点。该类疫苗的制备步骤如下：①了解编码具有免疫原活性的抗原蛋白对应的基因信息。②从大肠埃希氏菌、酵母、转基因动植物等表达系统中选择最适表达载体。如：酵母表达系统已经大规模生产人用重组肝炎疫苗。基因工程亚单位疫苗可细分为：细菌性疾病、病毒性疾病和激素亚单位疫苗。
1.细菌性疾病亚单位疫苗
分离和鉴定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究细菌性亚单位疫苗的基础，目前已研制出与炭疽、大肠杆菌病、牛布鲁氏菌病等对应的亚单位疫苗，均能对相应的疾病产生有效的保护作用。史百芬等发现RSVF蛋白亚单位疫苗（PFP-1）注射接种后接种者无呼吸道疾病加剧作用。
2.病毒性疾病亚单位疫苗
大多数病毒基因组已经被克隆和完全测序，因此病毒性亚单位疫苗的研制相对简单。现在病毒性疾病亚单位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中国台湾省科学家研制的禽流感亚单位疫苗效力远比灭活疫苗高。祁贤等应用酵母系统表达生产鸡传染性腔上囊病病毒VP2亚单位疫苗，发现其可完全取代传统灭活疫苗。
3.激素亚单位疫苗
该疫苗是以生长抑制素为免疫原的一类疫苗。杜念兴等将大肠埃希氏菌中表达的生长抑制素基因与HbsAg基因融合，通过Vero细胞表达，结果发现表达产物具有良好的免疫原性。杜念兴等用SS基因疫苗免疫小鼠，发现口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小肠表达HBsAg/SS融合蛋白，推测该基因疫苗刺激机体表达蛋白后能产生SS抗体。
（二）基因工程活载体疫苗
此类疫苗生产主要有两种方法，一是使非致病性微生物表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，进而产生免疫原性，另一种是致病性微生物被修饰或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。活载体疫苗结合了活疫苗和死疫苗的共同优点，在免疫力上具有很大的优势，分复制性和基因突变活载体疫苗。
（三）核酸疫苗
核酸疫苗接种后，抗原合成、增加与病原自然感染十分相似;还具有免疫原性单一;易构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于规模化生产等优点。
二、展望
疫苗开发具有安全性、有效性、价廉性、易推广性等特点。基因工程疫苗具有传统疫苗无可比拟的优点，是疫苗产品开发的主要方向。研制多联或多价疫苗是基因工程疫苗的主要发展方向。
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学生做好这一模块的题目，就需要从四个方面入手。即如何切入，何为重点，何为难点，如何改进。
关键词：基因工程；复习；切入点；重难点；改进和调整
中图分类号：G633.91 文献标识码：A 文章编号：1992-7711（2016）08-0005
在过去三年的江苏高考卷中连续出现了三道基因工程方面的题目，而且分值较高。这就不禁让笔者有理由推测明年的高考卷中势必还会出现这种类型的题目，所以笔者在复习这一模块时，特别总结了相关注意事项，并思考如何才能让学生理清思路、游刃有余地把这一模块的题做好。过去三年出的三道题目很类似，都是提供几种限制酶识别序列及切割位点图和转基因操作流程图，考查的重点问题都是限制酶对质粒和目的基因的识别与切割，以及切割后的重组问题，即目的基因的获取和表达、载体的构建。那么，我们的学生要想做好这种题目，还需要形成哪些方面的认识呢？笔者认为在复习时应该从以下四个方面入手：
一、以肺炎双球菌转化实验为复习的切入点
复习前先带学生重新认知该实验的过程，复习巩固生物之间的自然的基因转接过程。从学习角度分析，借助学生所熟知的原型，可以启发、引导以实现温故而知新。这个实验是一个很好的认知原型，让学生能够感悟到大自然的鬼斧神工造就了自然发生的重组DNA，那我们人为地也可以改变，即我们的基因工程。基因工程的操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取，基因的表达与载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。其中，获取目的基因和基因表达与载体的构建是整个工程的核心技术。这一技术涉及许多知识点，如DNA的结构、DNA的复制、限制酶和DNA连接酶及DNA作用与特性、基因的表达、载体的结构组成和作用等。因此，命题者可以从多个角度考查学生对这一系列知识的整体掌握程度及相关的能力。前几年的题目都分别考查了不同的限制酶切割目的基因和质粒后可得到重组质粒的种类、目的基因导入质粒后对质粒结构和功能的影响、DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体间的特异性结合、转基因植物栽培中降低害虫种群抗性基因频率增长速率的措施等问题。基因工程内容重要，基础性知识要求较高，涉及的知识和技术多，同一个问题还可以从不同的角度设置问题，笔者认为，教师在教学中、学生在学习中仍然要格外重视这部分内容。
二、基因工程是现代生物技术的核心内容
高中生物选修内容包括选修一《生物技术实践》、选修二《生物科学与社会》、选修三《现代生物科技专题》。其中，选修三选择了现代生物技术中深刻影响着人类社会的生活、生产和发展的四大工程：基因工程、细胞工程、胚胎工程、生态工程。由于基因工程是现代生物技术的核心内容，所以显得尤为重要。因此，我们在给学生复习的时候要特别重视基因工程的复习，但在复习方法上要侧重理论与原理，注重理解和应用，注重与必修内容、社会热点、生物科技发展的最新成果的联系，注重这些技术在农业、工业以及在医疗卫生事业上的应用，努力用已学的原理和技术去分析理解并解决其中的一些实际问题。复习的深度不宜过深，在操作技术上至少要求一般性了解，不宜过细。另外，微观的技术要注意采用模拟操作的方法加强理解，宏观的技术要尽可能走进工厂或研究所参观学习，加强直观理解，实在没有条件的学校，要想办法找一些视频或录像反复地观看。只有做到理解，才能达到真正掌握和应用。笔者认为，学生之所以一直感到这部分内容难，主要原因就在于他们缺乏这一学习过程，而是局限于看书和记忆。所以，我们在复习这部分内容时一定要将这个过程给他们补上。
三、对双基的掌握和分析、解决问题的能力是复习的重难点
近几年的生物高考命题指导思想都强调以能力测试为指导，重点考查对基础知识和基本技能的整体掌握程度，力求引导中学全面实施素质教育。这一指导思想通过近几年的高考实践已经得到充分的证明，也就是要求学生全面掌握《生物课程标准》和考试大纲规定的基础知识和基本技能。这种整体掌握不但体现在必修和选修上，还体现在要求考生能在相对简单的情境中综合运用进行分析、判断、推理和评价。这一指导思想表现在试题上为：知识覆盖率高，注重基础知识和基本技能，重点内容、主干知识的考查出现频率高且相对稳定，试题的学科内、专题内和专题间综合性强。那么，像基因工程这么重要的知识在近三年高考题中连续出现的现象就不足为奇了。事实上像遗传规律的应用、人类遗传系谱图的分析、免疫、生态等内容也是连年考，但设置的问题和考查的角度不完全相同。这一指导思想要求我们学生既应踏踏实实地、全面系统地、重点突出地掌握基础知识和基本技能，也要能从不同的角度去理解知识，要能挖掘知识之间的区别和联系，并在不同的情境中运用知识。
一、考点解读
考点1 基因工程的理论基础
1.基因拼接的理论基础
（1）DNA是主要的遗传物质；
（2）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核糖核苷酸；
（3）DNA的双螺旋结构。
2.外源基因表达的理论基础
（1）基因是控制生物性状独立遗传的单位；
（2）遗传信息的传递都遵循中心法则；
（3）生物界共用一套遗传密码。
3.技术支持
基因转移载体的发现；工具酶的发明；DNA体外重组的实现；重组DNA表达实验的成功。
考点2 基因工程的操作工具分析
1.“分子手术刀”――限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。这种酶在原核生物中的作用是防止外来病原物的侵害，将外源DNA切割保证自身安全。
（2）作用特点：①切割外源DNA，对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的。
②专一性：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（3）作用结果：经限制酶切割产生的DN段末端通常有两种形式――黏性末端和平末端，如下图：
（4）作用实质：使特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开
2.“分子缝合针”――DNA连接酶
（1）类型：有两种DNA连接酶：E・coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。
（2）两种DNA连接酶的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：
E・coliDNA连接酶来源：大肠杆菌作用：使黏性末端之间 连接
T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用：既能连接黏性末端，也 能连接平末端，但后者 效率低
【易错警示】限制性内切酶和DNA连接酶的作用部位都是脱氧核苷酸之间形成的磷酸二酯键（不是氢键），只是一个是切开，一个是连接。
3.“分子运输车”――载体
（1）作用：①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内；
②利用载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存；
②具有一至多个限制酶切点，供外源DN段插入；
③具有标记基因，方便对重组DNA的鉴定和选择。
（3）种类：①最常用的载体是质粒，它是一种的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
②其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【归纳总结】①一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
②限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
③质粒是最常用的运载体，而不是唯一的运载体，除此之外，噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。运载体的化学本质为DNA，其基本单位为脱氧核苷酸。
考点3 基因工程基本操作程序分析
1.目的基因的获取
（1）直接分离：
从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库中获取。
（2）人工合成目的基因：
常用的方法有：①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
②以RNA为模板，在逆转录酶作用下进行人工合成。
（3）PCR技术与DNA复制的比较：
PCR技术DNA复制
相同点原理DNA双链复制（碱基互补配对）
原料四种游离的脱氧核苷酸
条件模板、ATP、酶等
不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化
场所体外复制主要在细胞核内
酶热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内含有的DNA聚合酶
结果在短时间内形成大量的DN段形成整个DNA分子
2008－2010年高考生物江苏卷中连续出现了三道基因工程方面的大题，它们是2008年的第32题(8分)、2009年的第34题(7分)、2010年的第27题(8分)。2011年的第33题(8分)。下面以这几道题目为例深度分析该类试题易考知识点及几点思考。
1 试题分析
2008年第32题主要考查了：PCR中使用的DNA聚合酶的最主要特点(耐高温)；PER中退火温度的设定与引物DNA的碱基种类的关系(G-E碱基对多，DNA结构稳定，退火温度高)；DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专业性要求(没有)；将目的基因导入植物细胞采用最多的是农杆菌；两种限制性内切酶切割重组质粒得到DN段的种类。
2009年第34题中第(1)(2)小题考查了两种不同的限制性内切酶切割目的基因和质粒后可得重组质粒的种类。第(3)小题考查目的基因导人质粒后对质粒结构和功能的影响(只能在特定位置，不能在质粒复制原点、启动子、终止子及抗生素抗性基因中)。第(4)～(6)小题分别考查了DNA水解酶、毒素蛋白与受体细胞中受体问的特异性结合、转基因植物栽培种降低害虫种群抗性基因频率增长速度的措施等问题。
2010年第27题仍然考查了质粒DNA热稳定性与碱基种类的关系、酶切位点的选择(不能破坏质粒标记基因及目的基因)、DNA连接酶的作用、单酶切载体和目的基因自身环化的问题(这个问题比较新颖，需要一定的实践经验，考生一般是想不到的，要解决这个问题只有选择两种不同的限制性内切酶来切割目的基因和载体)、目的基因表达的检测与鉴定的具体操作方法(这个问题涉及到配制选择性培养基的问题，由于教科书中缺乏这方面的知识，考生一般无法作答)。
2011年第3题考查了利用PCR技术扩增目的基因的原理和用限制酶切割质粒产生的位点问题。这部份内容教材当中虽然有相关知识点但学生回答时必须对书本知识有深入的理解的应用。试题中所提出的PCR技术扩增目的基因时出现的问题，是在PCR技术扩增目的基因实际实际操作中经常发生的问题和必须解决的问题，可以说这个考点来源于实际生产或者实验，对于有实验或实践经验的学生和老师解答起来没有问题，但是有多少学生做了PCR技术扩增目的基因这实验呢，出题者的意图是希望教材中应该做的实验应该让学生动手操作，让学生体会实验教程和解决实验过程中出现的问题。
以上列举了DNA重组工程的易考知识点和已考知识点，从易考知识点来看这类题目考查的方面很集中重复性也很强，但是从2010年的已考知识点来看这类题目的难度已经远远超出了课本的范围，对学生的实践经验要求很强(基因工程实验的学习应该是在大学课程中)，这对没有这方面经验的学生作答题目是很困难得。所以下面列举一些笔者能想到的未考查知识点。
2 对今后高考中考查基因工程内容的思考与展望
2.1 DNA连接酶的种类及作用
E.coli DNA连接酶只能将双链DN段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DN段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。
2.2 受体细胞选择原核生物(特别是大肠杆菌)的原因
原核生物遗传背景简单、繁殖快、多为单细胞；而真核生物遗传背景复杂繁殖较慢，都是多细胞生物，所以经常选择原核生物作为受体细胞，且大肠杆菌是原核生物中遗传背景最简单的模式生物，自然是受体细胞的首选。
2.3 目的基因进入大肠杆菌的方法(除去Ca2+之外)
重组质粒导入受体细胞最常用的是Ca2+处理受体细胞，使受体细胞在温和的环境下能吸收周围环境中DNA分子。除了Ca2+处理受体细胞外，还可以用电转化的方法在高压环境下使受体细胞细胞膜的通透性增强，重组DNA分子就容易进入细胞。一般情况下电转化的效率要比ca2+转化高100多倍，如果要求获得高效率的重组DNA分子就要采用电转化的方法将目的基因导入受体细胞。
2.4 检验自我复制的质粒导入受体细胞(主要是原核生物)后是否是重组的
2.4.1 如果自我复制的质粒连接的是带有标记基因(该标记基因与质粒上的标记基因不同)的目的基因
比如质粒上带有抗氨苄青霉素基因(ampr)，目的基因带有卡那霉素基因(kanr)，检验自我复制的质粒导入受体细胞后是否是重组的，只要将受体菌株在含有氨苄青霉素和卡那霉素的培养基上培养，能正常生长出来的菌株都是含有重组的质粒，没有重组的质粒在卡那霉素的培养基上是不能生长的。
2.4.2 如果自我复制的质粒连接的是没有标记基因的目的基因
关键词 基因工程；研究进展；原理；应用
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）10-0045-02
20世纪70 年代以来，基因工程技术在世界范围内蓬勃兴起，至今已在多个学科领域得到广泛应用。基因工程是一项能够较好地服务于人类社会的工程技术，该技术通过改变生物的遗传组成，增加生物的遗传多样性，由此赋予新型转基因生物的表型特征[1]。目前，以基因重组和克隆技术为代表的生物技术正以日新月异的速度迅猛发展。
1 基因工程原理
基因工程（genetic engineering）以分子遗传学为理论基础、以分子生物学和微生物学的现代方法为手段进行的研究，又称为DNA重组或分子克隆。通过体外重组，基因工程将不同来源的基因导入受体细胞，在体细胞内实现基因的复制、转录、翻译。这种技术是按照人们的意愿将某一生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割，然后与载体DNA分子连接起来，一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中[2-3]。对于受体细胞而言，与载体相连的DNA分子就属于外源物质也称为重组体。重组体导入到受体细胞之后就可以进行正常的复制和表达，从而获得新物种。一般来说，载体的选择对能否成功进入受体细胞并且复制和表达起着很重要的作用，载体进入受体细胞应该以不影响受体细胞正常生长为基本原则。这种技术克服了远缘杂交的不亲和，为改造生物提供了有效的手段。
2 基因工程的应用
2.1 植物基因工程技术在中草药研发中的应用
2.1.1 提高药用植物的有效成分含量。目前，学者在铁皮石斛上应用了基因工程技术，以提高其有效成分的含量。由于人工合成成本很高，若能够通过基因工程技术提高石斛碱的含量，会产生巨大的经济效益。魏小勇等[4]以铁皮石斛种胚原球茎为研究材料，定向诱导后获得稳定的石斛碱突变体，分析突变体的表达效果，并以mRNA为模板反转录产生cDNA，构建铁皮石斛差减cDNA文库，获得差异表达mRNA反义基因。通过构建相应载体转化石斛，来分析转基因石斛中石斛碱的变化，通过筛选反义基因来确定石斛碱功能基因。将类似铁皮石斛的稀缺植物上应用基因工程技术，可为中草药的研发奠定基础[5]。
2.1.2 提高药用植物的抗病性和抗逆性。一般对药用植物都是采用大规模的种植，由此才能满足市场需求。应用植物基因工程技术可解决栽培过程中的病害问题。如种植培养出的抗病毒、抗虫害品种，可增强植物对病害的抵抗能力，不仅能降低植物病害的发生，还能减少由于使用农药而带来的污染[6]。Pilon-Smit et al[7]将SacB基因导入烟草，提高了转基因烟草的耐旱抗寒特性。我国学者也开展了植物基因工程技术的研究和应用，并取得了显著的成果。贺 红等[8]以枳壳实生苗上胚轴为研究材料，为获得转柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因的植株，其采用了遗传转化技术。有学者还利用Ti 转化系统获得了多种抗病毒的植物，如抗黄瓜花叶病毒（CMV）的番茄和抗甜菜坏死黄脉病毒（BNYV）的甜菜等[9]。
2.2 基因工程在植物性食品脱敏中的应用
基因工程可以将目的基因导入受体细胞，也可以改变内源基因，只要找到需要删除的基因即可。过敏反应具有反应迅速的特点，过敏原种类也很多。因此，防止发生过敏反应也很困难。基因工程可以直接作用于过敏源头，即改变内源基因使编码的蛋白质失去致敏性。也可以通过基因工程方法处理食品及其原料可降低其致敏性，从而降低过敏病人的不良反应。反义技术可消除植物中内源基因，使致敏基因沉默，从而降低植物性食品致敏性[10]。
2.3 转基因技术在哺乳动物遗传育种领域的应用
随着分子生物技术的发展，人们可以根据意愿改良动物品种，结合基因技术原理的应用，由此实现重要的经济价值。在畜牧业生产上，主要是用于遗传改良，加速动物育种。转基因可以定向培育并保存物种的优良性状，并能加快其积累和保存的步伐。在大量的转基因动物中选出符合人们预想的转基因动物，利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，用于大量生产转基因动物。将转基因技术应用于家畜上，在动物体内转入结合特异抗原抗体基因，可生产出具有抗多种疾病性能的动物[1]。转基因技术的科技含量较高，但在实验室内也能实现动物育种。在动物杂种优势利用方面，转基因技术可加速动物育种的进程，增强选育种畜性状的稳定性，降低育种的时限并提高效率[11]。
2.4 基因工程在食品工业中的应用[12-14]
2.4.1 糖类的改良。淀粉是一种多糖，通过对酶的调控可控制其含量水平，ADPP葡萄糖焦磷酸酶、淀粉合成酶和分枝酶是高等植物的淀粉合成酶。将淀粉系土壤大肠杆菌的基因转移到马铃薯上，可增加马铃薯的淀粉含量[12]。这种基因可表达ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，使马铃薯淀粉含量增加近20%[15]。目前，利用植物基因工程技术改善食品的风味已取得重大的进展。Monsanto公司开发出转基因马铃薯，新型马铃薯产品的淀粉含量较传统品种平均提高了20%～30%，油炸后的产品具有更好的构质和风味，并且油味和吸油量都较少[16]。
2.4.2 改善发酵食品风味。发酵食品具有工业经济效益，其品质将直接影响效益。但是在该领域不能广泛地应用传统的微生物，否则不能达到定向改造微生物性状的目的。因此，选择的微生物将决定发酵食品风味。随着分子生物学的兴起，在分子水平上可利用DNA 重组、RNA 干扰及基因敲除等基因工程技术来构建所需的基因工程菌株[17]。
例如，在啤酒和酱油的生产工艺中可利用转基因技术改善产品的风味。在酿造酱油的过程中，氨基酸的生成量对整体风味起决定性的作用，参与该反应的羧肽酶和碱性蛋白酶的基因已克隆并成功转化到菌株中，羧肽酶的活力可大幅提高13倍，碱性蛋白酶的活力可提高5倍，从而提高氨基酸的生成量[18]。为满足不同食品的需要，在酱油的酿造工艺中可使用工程菌株，由此降低酱油的色度和口味。啤酒中含有一种叫双乙酰的物质，双乙酰是啤酒酵母细胞产生的α-乙酰乳酸经非酶促的氧化脱羧反应自发产生的，当双乙酰含量超过风味阈值（0.02~0.10 mg/L）时，就会大大降低啤酒的口感，产生馊酸味，进而影响经济效益。为改善啤酒的风味，可采用α-乙酰乳酸脱羧酶去除双乙酰。研究表明，利用转基因技术将编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆到啤酒酵母中进行表达[15]，可以有效降低啤酒中的双乙酰含量。基于基因工程原理，还可将转基因技术应用于制取其他产品[19]。
3 展望
目前，基因工程技术已渗透到人类生产生活的各个领域，其以巨大的生命力发挥重大的影响，一些实验室技术和成果不断地得到应用，也将使地球的生物圈变得更加丰富多彩[20]。如今基因工程技术在给人类带来利益的同时，对于疾病的治疗方面也有了巨大突破。尽管基因工程技术给人类带来了巨大的利益和便利，但同时也应该思考转基因食品的安全性问题，这是对基因工程未来发展的最大挑战[21-22]。
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笔者根据课标要求，结合考纲和近年高考考点将近年基因工程考点总结如下。
一、 基因工程的基础知识
基因工程的理论铺垫――分子生物学发展：
① 艾弗里证明了DNA是遗传物质。
② 沃森和克里克证明了DNA双螺旋结构。
③ 尼仑贝格破译了遗传密码。
二、 酶切
基因工程选择限制性内切酶作为工具，主要是因为它具有比一般酶更高的专一性。由于其具有较高的专一性，因此在基因工程的具体操作中如何选择限制性内切酶是高考的重点考察内容。
1. 限制酶的特异性
例1 判断用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸是否可行？_____。
答案 不可行
解析 限制酶的专一性非常强，其特异性表现在三个方面：识别DNA、识别特定序列（回文）、切割特定位点磷酸二酯键。由于烟草花叶病毒是RNA病毒，所以限制酶不能识别RNA。
另外要特别注意限制酶切割以后的结果，磷酸二酯键断裂，暴露出新的磷酸基团。
2. 限制酶的选择
正确选择限制酶是基因工程中一件非常重要的任务。限制酶的选择应当遵循以下一些原则：不破坏目的基因；不破坏标记基因；目的基因和运载体上都有限制酶的切割位点。当然也要注意用一种限制酶和两种限制酶切割的区别。
例2 与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_________
______________________。
答案 质粒和含目的基因的外源DN段自身环化
解析 基因工程中目的基因和质粒可以用同一种酶切，也可以用两种酶切，若用一种酶切，质粒只要切一个切口，目的基因需要切两个切口；若用两种酶切，质粒要切两个切口，目的基因也需要切两个切口。一种酶切出的4个切口都相同，所以有多种连法，两种酶切出的质粒和目的基因上的4个切口两两相同，因此可以防止自身环化。
3. 同尾酶
限制酶种类多样，一些酶之间关系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ识别不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它们切出的末端可以连接，被称为同尾酶。
例3 已知限制酶I的识别序列和切点是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。根据下图示判断下列操作正确的是（ ）
A. 质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
答案 A
三、 连接
1. 连接物类型
经过限制酶切割过以后，暴露出的相同的黏性末端可以自动连接，考生同时需要考虑：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因两端的两个黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；质粒上的两个黏性末端。综合以上结论，连接产物的类型可能就比较多，如目的基因-目的基因连接物、目的基因-运载体连接物、运载体-运载体连接物、其他DN段-运载体连接物、目的基因自连、运载体自连，若用同一种酶切时后两种连接物不存在。
2. 连接酶
下表简要总结了基因工程中常见酶的特性差异。
例 PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_____________
___________________。
答案 DNA聚合酶只能将单核苷酸连接到双链DN段的引物链上
解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么连接酶能否催化以上反应呢？也不能，因为连接酶必须将两段DNA相连。RNA聚合酶能否催化以上反应呢？也不能，因为RNA聚合酶虽然不要引物，但其不能催化T参与反应，只能利用U。虽然这些酶都是催化磷酸二酯键，但它们作用的底物差异较大，所以一定要注意辨析。
以上主要介绍了基因工程的三种操作工具，这些内容当然是高考的重点和热点。除此之外有些内容也应当给予一定关注，如：目的基因的获取；目的基因的扩增（PCR）；土壤农杆菌介导的目的基因的导入；重组质粒的筛选；目的基因的检测；转基因生物的安全性；转基因生物的利用等问题。
巩固训练
1. 目前人类利用基因工程的方法成功培育出转基因抗虫棉，以下说法正确的是
（ ）
A. 标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因
B. 抗虫基因导入棉花叶肉细胞后，可通过传粉、受精的方法，使抗虫性状遗传下去
C. 苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因与质粒结合后直接进入棉花的叶肉细胞表达
D. 转基因抗虫棉经过种植，棉铃虫不会产生抗性，这样可以有效消灭棉铃虫
2. 下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。
（1） 将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X-1混合连接，连接后获得的质粒类型有______。（可多选）
A. X-1 B. X-2
C. X-3 D. X-4
（2） 若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有____________、____________。
（3） 如果X-1用E1酶切，产生850对碱基和3 550对碱基两种片段：那么质粒X-2（Tcr基因的长度为1 200对碱基）用E2酶切后的片段长度为______对碱基。
（4） 若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X-1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X-4的细胞数与含X-1的细胞数之比为13，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________
________________________。
3. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，图l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。请回答下列问题：
（1） 将提取的质粒与外源DNA分别加入缓冲液中，选用相应的限制酶处理时，影响处理效果的外界因素主要是______等（写出两点）。
（2） 用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，能否使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA？答：______，原因是______
___________________________。
（3） 可选用______（两种）限制酶同时酶切质粒与外源DNA，酶切并连接后可获得______种含目的基因的重组质粒，筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时，需要在含______的培养基上培养。
（4） 为了从基因文库中分离获取T2噬菌体抗性基因，将重组质粒导入对T2噬菌体敏感的大肠杆菌，然后将含有该大肠杆菌的菌液分别接种在预先涂有______的培养基上培养，从而初步检测目的基因的表达。
答案
1. A 2. （1） ABC
（2） 无质粒细胞 含X-3的细胞
（3） 4 750
（4） 不能 DNA连接酶对DN段没有选择性或者DNA末端相同
3. （1） 温度、pH
（2） 不能 MspⅠ会切割质粒上的两个标记基因，而BamHⅠ会切割破坏目的基因
基因工程在医学上已得到广泛应用，并且应用领域不断被拓宽，取得了令人惊喜的成就。
1 基因工程制药
基因工程制药开创了制药工业的新纪元，解决了过去不能生产或者不能经济生产的药物问题。现在，人类已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人的胰岛素、尿激酶、红细胞生成素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。令人振奋的是，具有高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏儒症等提供了有效的药物。众所周知，医治侏儒症的良药是人生长激素，倘若从人的尸体中获取，治疗一个病人就需要600具尸体的脑下垂体才能获得足够的量；倘若运用基因工程生产，就可从每升基因工程菌液中得到2．4g。人们为此而石破天惊的兴奋!成本如此之低，又如此之高产，其巨大的经济效益和社会效益，由此可见。
2 基因工程抗病毒疫苗
为人类抵御病毒侵袭提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血热病毒疫苗、轮状病毒疫苗等应用于临床，提高了人类对各种病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的问世，使我国新生儿不再遭遇乙型肝炎病毒的侵袭，也降低了人群肝癌的发病率。又如，为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”，就是按照人类的设计，把“生物导弹”发射出去，精确地命中癌细胞，并炸死癌细胞而不伤害健康的细胞。就单克隆细胞而言，单克隆细胞在肿癌的诊断检测、显示定位、监测病变、监测疗效等方面也有重要价值。人类还通过基因工程生产抵御各种病菌、血吸虫、虐原虫等疫苗，提高人体对各种传染病的免疫力。脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世，变革了机体的免疫方式。如今，人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒)疫苗的早日问世。基因工程抗体技术的发展，为克服单克隆抗体生产细胞株在生产过程中的不稳定性，为生产大量高效抗病毒疫苗提供了先进的生产工艺。
3 基因工程治疗疾病
临床实践已经表明，基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如，不治之症——白痴病，用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因，就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传疾病约有4000种，包括单基因缺陷和多基因综合征。运用基因工程技术或者基因打靶的手段，将病毒的基因杀灭，插入校正基因，得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。人类精心设计的基因工程操作，克服了不同个体甚至物种之间由于器官移植所产生的免疫排斥作用，实现人体之间的移植已获成功，成功的实体器官移植有肾、心、肝、胰、肺、肠，也有双器官和多器官的联合移植。而人体与动物之间的器官移植成为现实，临床应用已是指日可待的事了。脱氧核糖核酸化学合成的完善和自动化，脱氧核糖核酸扩增技术的优化，为合成基因“探针”，提高临床诊断的质量，是人类所殷切企盼的。基因治疗有两种途径，一是体细胞的基因治疗，二是生殖细胞的基因治疗。体细胞的基因治疗是将正常的遗传基因导入受精的卵细胞内，让这种遗传物质进入受精卵的基因组内，并随着受精卵分裂，分配到每一个子细胞中去，最终纠正未来个体的遗传缺陷。而生殖细胞的基因治疗是将人类设计的“目的基因”导入患有遗传病病人的生殖细胞内，此法操作技术异常复杂，又涉及伦理，缓行之理充足，故尚无人涉足。
4 基因工程诊病
