时间：2023-06-22 09:23:03
序论：在您撰写动物医学研究时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
【关键词】 生物医学；动物；实验
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.09.785 文章编号：1004-7484（2013）-09-5430-01
近年来，生物医学研究工作发展迅猛，实验动物在生物医学研究中的作用也愈发突显出来。实验动物的应用领域非常广泛，无论是在疾病的预防、诊断、治疗方面还是药品、器械的安全性评价方面都非常理想，为众多生物医学研究提供了可靠的保证。我国实验动物应用发展日臻成熟，但是在实验动物管理工作中仍存在许多问题。如实验动物设施管理不规范、实验动物和标准化的实验环境及条件不规范等问题仍然十分普遍。这些问题不仅会对实验结果的准确性、可靠性和重复性产生较大影响，同时也严重违反实验动物福利原则。因此，建立系列的实验动物管理规范、开放专业动物实验室、创建动物实验服务技术平台等需要在今后的工作中逐步完善。
1 实验动物应用规范化
规范的实验动物模型的基本要求是能够准确再现，对影响因素严格控制，保证各项指标的一致性。生物医学研究中能够影响实验结果的因素主要有动物因素和环境因素，其中动物因素包括：遗传、性别、年龄、健康状况等；环境因素包括：营养、气候、理化、居住等[1]。因此，规范实验动物设施管理工作，对实验结果的可靠性具有重要意义。
1.1 实验动物设施规范建设 实验动物科学是一门边缘的、交叉的学科，需通多学科、多领域共同完成。在实验动物设施建设中，实验动物环境设施是核心任务，也是实验生物的生存基础。只有实验动物设施规范建设工作规范化才能提高教学和科研的质量，保证实验结果可靠。
实验动物环境设施按照功能的不同可分为实验生产设备和动物实验设施；在两种设施中根据空气净化程度要求的不同分为普通环境设施、屏障环境设施、隔离环境设施；三种设施环境又从安全性的角度划分为正压环境和负压环境[2]，见表1。
1.2 实验动物消毒管理 不同的实验动物的饲养环境会不同程度地影响其生长发育情况及各项生理指标，这些因此都会影响到实验结果的准确性。因此，对实验动物饲养和实验过程中的消毒工作提出了非常高的要求。通过合理的人流、物流、动物流和气流安排，结合完善的消毒灭菌制度可以有效防止动物实验中发生交叉污染，保证动物实验的质量和可靠性。消毒工作[3]要以动物饲料、饮水、居住环境消毒为主，不断加强及完善饲养人员的职业安全卫生防护措施，规范操作流程。
1.3 人员管理 我院在实验动物管理中非常注重的工作人员的管理。动物实验设施工作的人员必须经过严格的技能培训与考核，能够熟练地掌握实验中的无菌操作和各种仪器设备的使用，并且严格执行标准操作规程（SOP），强化工作人员的无菌观念。
2 实验动物应用现状
2.1 实验动物种类和品系选择 目前生物医学研究选取的动物种类主要有：大鼠、小鼠、猪、犬、猴、兔、猫、豚鼠、果蝇、两栖类和鱼等[4]。各种动物所占的比例大概为：小鼠占38%左右，大鼠占25%左右，兔子占7%左右，犬占6%左右，其他特种占24%左右。在最新的调查中显示：大鼠的使用率呈下降趋势，小鼠的使用率在2002年首次超过大鼠；非哺乳动物的使用率逐步升高，鱼和果蝇的使用量也有所增加，鸡的使用率变化不大。
2.2 转基因动物应用 转基因动物（Transgenic Animals）是指可以用试验导入的方法使其外源基因在染色体基因组内稳定的进行整合，并能通过遗传复制给后代的动物。被导入动物基因组的外源基因被称为转基因（transgene）[5]。当外源基因在转基因动物体内表达并培育出表型与人类相似的动物模型，就被称为转基因动物模型。
目前，许多疾病很难通过人工定向培育的方法获得实验动物模型。转基因技术的出现为此提供了可能，转基因技术可以在动物原有遗传基因基础上，通过改变基因的表达水平以模拟人类疾病的动物模型。转基因动物模型产生疾病的原因清楚、模型动物的症状与人类相似。因此，转基因疾病动物模型在实验中的应用越来越广泛。
3 总结
实验动物对于人类健康的作用是不争的事实，动物实验是生物医学研究领域中不可替代的技术之一。近年来，由于人类对动物保护意识的兴起，实验动物面临严峻的伦理学问题日益突显出来。因此，在动物实验工作中要以人类健康为目的，在实验过程中将对动物的伤害控制到最低程度才能符合社会的伦理道德要求。
另外，要积极开展实验动物应用研究，规范实验动物工作，不断提高实验动物质量，以满足科研工作的快速发展；加强实验动物技术人员的培训和考核制度，定期对技术人员进行系统的学习和培训，提高人员素质。
参考文献
[1] 庞万勇，生，贺争鸣，等.美国实验动物医学发展简史——对中国实验动物医学发展的思考[J].中国比较医学杂志，2011，21（10）：335-337.
[2] 张国伟，戾雪涛，彭涛，等.实验动物替代技术在中国实验动物部分调查初步报告[J].中国比较医学杂志，2011，21（10）：1107-1109.
[3] 何宏星，黄黎玲，肖力，等.建立标准化动物实验技术服务平台的初探.实验室科学[J].2009，8（4）：41-43.
在开展生物医学研究时，研究者通过正确地运用统计学知识，可直接影响研究的质量。统计学设计的任务在于对研究的部署、实施，直到研究结果的解释进行系统的安排，力争做到以最少的人力、物力获得可靠的结论和信息。其目的在于确定某种处理是否会表现出某种特定的效应。在实验设计时应遵循惟一差异原则，即在进行两组比较时，两者之间仅有因处理因素不同而引起的差异，而其他实验条件相关的非处理因素都应保持等同。然而，处理组与对照组在反应上表现出的差别并不一定意味着是处理的结果。另有两种引起差别的可能性，即偏倚和偶然性。偏倚是指系统性差别，它不是因组间在处理上的不同所引起。生物医学实验中统计学设计和分析的目标就是消除潜在的偏倚，减少偶然性[2]。
1.1实验的偏倚和控制
偏倚是在研究中从设计到实验实施和结果分析的各环节存在一些人为的、有系统倾向的非随机误差，它不是由于抽样造成的，而是某种偏性使得实验结果偏离它的真值。从所选择的生物医学问题到研究方案的制订与实施、实验的完成过程、实验的分析与解释，乃至实验结果的发表，均可能存在各式各样的偏倚[2]。这种偏倚常常表现为系统误差。偏倚的大小取决于研究的方法和具体的实验条件。常见的偏倚主要有选择性偏倚、观察性偏倚和混杂性偏倚。必须认识实验过程的偏倚，从实验设计起直到整个研究过程结束均要加以控制。正确的实验设计可控制选择性的偏倚，事前人为控制和采取相应的措施可避免和减少观察性的偏倚。对于混杂性偏倚，可将重要的混杂因素在设计阶段进行分层随机设计，使混杂因素在组间分布均衡；在统计分析阶段将混杂因素作为分层因素或采用有协变量分析方法，以消除混杂因素的影响。只有有效地控制或消除偏倚，方可减少结果的假阳性或假阴性。
1.2减少偶然性的潜在影响
偶然性因素的作用可以减少，但不能完全排除。因为即使是在精心实施的研究中，接受同样处理的动物，其反应也不可能完全一样。适当的统计分析可使实验人员评估出现假阳性的概率，即根本不存在处理效应的情况下观察到差异的概率。这种概率越小，实验者发现真实效应的可能性就越大。为了更有把握地检测出真实效应，有必要减少偶然性的作用，并通过实验设计确保能在“噪声”之上识别真正的“信号”。
1.3实验设计的要素
要消除生物医学实验中潜在的偏倚，减少偶然性，就应对实验对象、处理因素和实验效应这三个实验设计要素，按照对照、重复、随机化和均衡四项原则进行周到的设计与控制[3]。1.3.1实验对象实验中处理因素所作用的对象称为实验对象。不同性质的实验研究需要选取不同种类的实验对象，一个完整的实验设计中所需实验对象的总数称为样本含量。生物医学试验中考虑动物实验对象时应关注以下几个方面：①动物种属的选择：选择实验动物的种属与品系时，尤其需要注意其背景反应的水平。为了将反应“信号”水平最大化，常常意味着应避免选择那些背景反应水平极低的动物种属或品系，但如果采用过度反应的动物种属或品系也同样会出现问题。动物物种选择中的其他问题，无论是实际问题（寿命、体型、易得性、对动物学特征的了解情况）或是理论问题（生化、生理或解剖结构与人的相似性），都需要从专业的角度认真加以考虑和权衡。②动物的数量：虽然从统计设计角度考虑可得出某项实验所需的动物数（样本含量），但所得出的数值往往很大。因此，虽然样本含量估计是保证结论可靠性（精度和检验效能）的前提，但基于实验的可操作性及经济原则方面的考虑，应结合统计学的计算结果与以往的生物医学研究经验予以确定。③动物的体重与年龄：为确保实验对象的同质性，实验中所使用的动物体重与年龄应尽可能相近；动物体重的标准差不应超出平均值的10%；啮齿类等小动物年龄相差不应超出1周，大动物年龄相差不应超出1个月。④动物的分层：为了准确检测一种处理因素引起的差别，各处理组在可能影响实验结果的其他非处理因素方面应尽可能具有同质性。当存在动物亚系间的差别时，有两种方法可得到更为准确的结论。一是在结果分析阶段将亚系作为一个“分层变量”处理，包括对两个亚系的结果进行单独分析，然后将结果综合，得出处理效应的总结论；二是将亚系作为实验设计的“区组因素”，这种情况下可使对照组与处理组中每个亚系动物数量相等。除以上所讨论的“亚系”之外，其他的非处理因素，如性别、窝别、体重段等也可作为分层变量进行局部控制，并据此进行分层随机化分组。1.3.2处理因素设计实验研究时，要明确研究中的处理因素和影响实验效应的非处理因素。研究者希望通过对研究设计进行有计划的安排，从而能科学地考察其效应大小的因素称为处理因素或实验因素；研究者往往忽略对评价实验因素作用大小有一定干扰的重要的非处理因素或非实验因素（如动物的窝别、体重等）；其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。实验结果是处理因素和非处理因素共同作用而产生的实验效应，因此如何控制和排除非处理因素的干扰，正确显示处理的效应，是实验设计的基本任务。1.3.3实验效应实验效应是处理因素作用于受试对象的反应和结果，是反映实验因素作用强弱的标志，它通过观察指标（统计学常将指标称为变量）来体现。如果指标选择不当，未能准确反映处理因素的作用，获得的研究结果就缺乏科学性，因此选择好观察指标是关系整个研究成败的重要环节。指标的观察应避免带有偏性或偏倚，要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高、准确可靠的客观指标。对一些半客观（如尿液pH试纸读数值）或主观指标（行为测量、病理观察），一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析实验结果，从而提高实验结果的可信度。
1.4实验设计的原则
为了防止结果的偏倚，保证实验结果的准确性和最大化的表达，在进行生物医学实验设计时必须遵循统计学设计的对照、重复、随机化和均衡四个基本原则。生物医学实验中对照组的设置必须具备三个条件：①对等原则，即惟一差别原则，除处理因素外，对照组具备与实验组对等的非处理因素。在相互比较的各组间，除了给予的处理因素不同外，其他方面应与实验组具有一致性，如相同的实验单位来源（动物种属、体重等）和相同的实验条件、操作方式和喂养环境等。②同步原则，对照组与实验组设立之后，在整个研究进程中始终处于同一空间和同一时间。③专设原则，任何一个对照组都是为相应的实验组专门设立的。不得借用文献上的记载或以往结果或其他研究资料作为本研究之对照。
1.5生物医学中常用的实验设计类型
如果需要在同一实验中同时评价几种不同的效应，实验者应该安排能区别各自效应差别的实验设计方法。生物医学中常用的实验设计有以下几项。1.5.1完全随机设计完全随机设计是生物医学动物实验中最为常用的一种实验设计方法，它是一种单因素有k个水平（k≥2）组的实验设计。即实验设计可设置一个对照或多个剂量组的实验方案。本设计保证每个实验动物都有相同机会接受任何一种处理，而不受实验人员主观倾向的影响。本设计应用了重复和随机化两个原则，因此能使实验结果受非处理因素的影响基本一致，真实反映出实验的处理效应。1.5.2随机区组设计随机化完全区组设计，简称随机区组设计，又称配伍组设计，是配对设计的扩展，它将几个条件相同的受试者划分在同一个区组或配伍组，然后再按随机的原则，将同一配伍组的受试者随机分配到各实验组。该设计方法的优点是每个区组内的k个实验单位有较好的同质性，比完全随机设计更容易察觉处理间的差别。这种方法须特别注意的是要求区组内实验单位数与处理数相同，实验结果中若有缺失值，统计分析将损失部分信息。1.5.3拉丁方设计拉丁方设计从横行和直列两个方向进行双重局部控制，使得横行和直列两向皆成区组，是比随机区组设计多一个区组因素的设计。在拉丁方设计中，每一行或每一列都成为一个完全区组，而每一处理在每一行或每一列都只出现一次，也就是说，在拉丁方设计中，实验处理数=横行区组数=直列区组数=实验处理的重复数。1.5.4析因设计析因实验设计又称全因子实验设计，属于多因素、多水平单效应的设计。它不仅可以检验每一因素各水平之间的效应差异，而且可以检验各因素之间的交互作用。交互作用是指一个因素不同水平间的效应差受另一因素的影响，包括协同交互作用和拮抗交互作用。析因实验主要用于分析交互作用，当因素及水平数过多时，所需的实验对象数、处理组数和实验次数大幅度增加，故一般采用较简单的析因实验。含有较多因素和水平的实验一般采用正交实验设计[5]。
2生物医学动物实验的描述统计学
2.1生物医学实验资料的类型
生物医学实验对实验对象（动物）进行干预后测定的观测指标通常有以下类型：①连续性数据：测定结果表现为有数字大小和单位的数据，统计上称定量资料，如生理、生化指标，体重值，器官重量等。②分类数据：测定结果表现为按某属性划分的定性类别，统计上称为定性资料，具体又可以分为二值资料、多值名义资料和多值有序资料。如某反应为出现或不出现，死亡或未死亡，有畸形或无畸形；病理损害的严重程度（无、轻度、中度、重度）等。
2.2统计描述指标
描述性统计学（或归纳统计学）是对样本观察/测量数据频率分布的定量研究，描述性统计的目的在于：①对测量值或观察值进行归纳浓缩，用统计量、统计图或统计表的形式表现；②估计总体分布的参数。2.2.1资料的整理与探索对于某一测量指标，一般应从文献资料中了解其分布类型。如果没有判断概率分布的理论基础，应重复以大样本测定，绘制样本的频数分布图（理论上样本量要大于100），并经统计学检验拟合其分布。2.2.2数据的描述统计量①连续性数据的频数分布：通过对样本资料编制频数分布表或做茎叶图，以确定资料分布的类型、频数分布的集中趋势和离散趋势、估计总体参数，也便于发现离群值。②中心位置的描述统计量：描述数据分布的集中趋势，常用指标为算术均数、中位数、众数、几何均数等。③离散程度的描述统计量：描述数据分布的离散趋势，常用指标为标准差和方差、极差和四分位数间距、变异系数和离散系数等。④统计学图表：统计图包括连续性数据分布的直方图、茎叶图，表示数据中心位置和离散程度的点杆图（做图时表示均数和标准差）和盒须图（做图时表示中位数、极差、四分位数间距），描述构成比数据资料的百分条图、饼图，描述经时变化趋势的线图，以及预测和检验分布类型的概率-概率图（P-P图）等[6]。统计表具有简单、明了、易于理解、便于比较的优点。编制统计表时原则上应当重点突出、层次分明、避免层次过多或结构混乱。一般的统计表应为三线表，表中只有横线，无竖线和斜线。统计表的标目应层次清楚，不宜过于复杂。
3生物医学动物实验的假设检验
生物医学动物实验中最常见的情况是给予不同受试物后进行组间比较，通过统计学中的假设检验，说明受试物的作用。假设检验时应注意以下问题。
3.1检验方法的选用依据
3.1.1资料的类型和变量的数目不同类型的资料（定量、定性）的组间比较应采用不同的统计检验方法。单变量、多变量的统计检验方法也各不相同。3.1.2实验设计类型应该根据实验设计的具体类型选择对应的统计检验方法，以便得到处理组效应的真实结论。3.1.3检验方法的前提条件选用假设检验方法前，应了解所分析的数据资料是否满足相应检验方法的前提条件，如t检验和方差分析等参数检验方法要求数据满足正态性和方差齐性，χ2检验要求样本含量大于40且理论频数大于5。
3.2正态性检验及拟合优度检验
统计学假设检验须判定样本的频数分布是否符合某一理论分布，如符合要求就可按此理论分布来进行统计学处理。对正态分布可采用正态性检验，其他分布可用拟合优度检验。通常可通过查阅文献，了解实验参数符合何种理论分布。
3.3方差齐性检验
连续性数据未达到参数法统计分析前提的第二种原因即为方差不齐。一般而言，数值愈大，其固有的变异性也愈大。例如，若某组动物的平均反应值为100，其数值范围可能为80~120；而另一组动物的平均反应值为300，其数值范围可能会扩大至240~360。解决方差不齐的措施是进行数据转换。若数据的标准差与平均值成正比，在统计分析前宜将数据转换为对数值之后再进行分析，据此，不仅数据的变异度与平均值大小无关，同时还可确保其更符合正态分布。若数据变异度增加幅度与平均值的关系不太明显，采用平方根转换则更易使数据的变异度与平均值大小无关。某些数据经对数或平方根转换后可能仍存在方差不齐，此时宜采用非参数检验。
3.4单侧检验与双侧检验
检验假设选择单侧检验或双侧检验，应事先根据专业知识做出选择。一般而言，若研究目的仅须了解是否存在组间差异、实验者无法预测组间变化的方向以及实验者希望获得正负两方面的结果时，应采用双侧检验。若事先可预测组间差异的变化方向，实验者仅对某一方面的重要性感兴趣，实验者仅希望了解与对照组差异或正或负一个方向，则应采用单侧检验。此外，剂量设计预试验中应采用双侧检验，正式试验在了解相关信息后可采用单侧检验。
3.5多重比较及多重性问题
生物医学实验经常在处理组和对照组之间做多个变量的比较。即使不存在真正的实验效应，也有可能纯粹由于偶然性而有一个或多个变量在5%检验水平出现显著性差别。除了上述均数多重比较导致Ⅰ类错误概率增加的多重性问题之外，其他的多重性问题还包括多次的中期分析、关注多个结局、亚组间的多重比较。处理多重性问题的原则包括：①预先计划进行多重比较；②限制比较的次数；③多重比较时采用更严格的界值标准；④多重比较具有生物学方面的依据。
3.6观察值或实验对象的独立性
许多统计检验方法要求比较的观察值或实验对象相互独立，如二项分布的率检验、t检验和方差分析等。但是，有的生物医学实验中观察单位并不独立。例如，生殖和发育研究中就存在窝效应：由于遗传因素、宫内的发育环境和药物的代谢环境相似，与异窝胎仔相比，同窝胎仔之间对毒性效应的反应概率趋于系统，即同窝内数据为聚集性数据，这就是一种常见的非独立数据。在统计学分析时，忽略数据的窝内相关性具有潜在的风险；因同窝母鼠所产k个胎仔的观察值存在共性，其所提供的信息不及k个独立的来自不同母鼠所产胎仔所提供的信息；窝内相关性愈大，其信息量愈少。聚集性数据的均数标准误小于独立的数据，因此，若基于观察值独立的统计分析方法，就会增加犯Ⅰ类错误的概率，即假阳性的风险增加，降低实验的有效性。
3.7历史对照数据的应用
某些情况下，尤其是在发生率较低的情况下，单项研究可能提示处理可影响肿瘤发生率，但无法得出明确的结论。可能想到的分析办法之一是将处理组的数据与来自其他研究的对照组动物相比较。虽然历史对照数据具有重要意义，但值得强调的是，众多原因可导致不同研究之间的变异度大于研究之内的变异度。动物来源、饲料及饲养条件，研究期限，研究中的动物死亡率、读片的病理学家等均可能影响最终的肿瘤发生率。故此，忽视这些差异，将处理组的肿瘤发生率与合并的对照组发生率相比较，可能得出严重错误的结果，并进而明显夸大统计显著性水平。Tarone[4]曾对历史对照组的比率数据分析进行过综述。
3.8假设检验的局限性
1.1生长与繁殖特性
宁乡猪的繁殖期长，且繁育能力较强。公猪3月龄性成熟，5～6月龄可配种。母猪4月龄第一次，7～8月龄可配种，利用年限约8～10年。成年母猪的有效可达12只以上，每胎产活仔数8～12头。
1.1.1种质特性朱吉等［1］发现宁乡猪经营养物质条件的改善及饲养科学的适应性变化，肢蹄卧系率降低92.2%，体尺体重性状和繁殖性状提高率分别达6.97%～27.67%、11.62%～17.44%，窝重提高率达26.91%～78.97%，特别是阉猪的生长速度和胴体性能明显提高。宁乡猪母猪日增重表现为前期低、中期高、后期下降的生长曲线，阉猪表现为前期高、中期低、后期回升的生长曲线，阉猪和母猪都具有生长肥育期日增重曲线的相似性。后备公猪的体重及体尺指标不及同龄母猪，主要是性成熟过早所致。
1.1.2肥育性能Rorz指出，改变日粮组成分与结构可以减少3.2%～62%的氮排出。宁乡猪与瘦肉型猪氮的消化利用能力存在差异，宁乡猪12.91%蛋白质日粮组具有较好的能氮平衡性。研究表明在宁乡猪生长肥育后期添加一定量的半胱胺可促进生长、提高胴体瘦肉率和改善猪肉品质。宁乡猪杂交组合具有较高的生长速度和胴体品质。宁乡猪生长肥育性能的可塑性较强，阉公猪的生长肥育性能优于母猪，优化饲粮是提高其肥育性能的基础。宁乡猪肥育期日增重与膘厚、肥育率呈正相关;胴体长与胴体宽、后腿重与腿臀围呈强正相关，与肥肉率呈弱正相关，与瘦肉率呈弱负相关;眼肌面积与瘦肉率呈弱负相关，而与肥肉率呈弱正相关。最近研究表明由于宁乡猪肥膘产量高，相对产值较低，所以55～85kg阶段是宁乡猪的最佳屠宰期。
1.1.3母猪营养需要研究表明宁乡猪母猪妊娠前期、妊娠后期和哺乳期能源分别为37%～39%、22%～24%和39%～41%，相应的日摄食标准消化能分别为18.9MJ、27.0MJ和45.5MJ，粗蛋白质分别为156g、242g、538g;提高母猪哺乳期采食量是节省能量、提高仔猪增重的重要途径，补饲青料可提高母猪的饲料利用率。近期研究表明14%以上的日粮蛋白水平有利于促进宁乡猪母猪的生长发育［7］。
1.2生理、生化指标研究表明宁乡猪白细胞总数、红细胞体积、淋巴细胞计数及血小板均低于三元猪;甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白与血清甲状腺素T3含量高于三元猪，血清甲状腺素T4和胰高血糖素含量下限值低于、上限值高于三元猪，血清葡萄糖含量低于三元猪可能与胰岛素含量高于、胰高血糖素低于三元猪有关。与近交系五指山小型猪、广西巴马猪和贵州小型猪等国内小型猪相比，宁乡猪的碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、低密度脂蛋白-胆固醇和总胆固醇较高，而γ-谷氨酰转移酶、三酰甘油、肌酐和高密度脂蛋白-胆固醇较低;与杜洛克猪、长白猪、大约克夏猪等国外引进品种猪相比，宁乡猪的丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶明显较高，总胆固醇明显较低，γ-谷氨酰转移酶、总蛋白、白蛋白、尿素氮、葡萄糖相差不大［9］。郭洁平等［10］研究发现与长白猪相比，宁乡猪血清精氨酸、一氧化氮浓度较低，空肠前段和肝脏一氧化氮合成酶活性较高，肾脏中的一氧化氮合成酶活性最低，肠道和肝脏中N-乙酰谷氨酸合成酶mRNA表达水平最高。
1.3病理特性研究发现猪流感(H3)诱发宁乡猪高热病病理变化主要在呼吸器官，表现为气管、支气管充血，肺肿大，小叶间质增宽，肺尖叶有实质病变，肠胃出现卡他炎症、弥漫性出血。外来良种猪及其三元杂交、二元杂交生猪发病严重，死亡率高，宁乡猪及其与外来良种猪的杂交后病症状较轻，治疗也容易一些，有的生猪甚至不治而康复，死亡率也相对较低［12］。
1.4肉质性状宁乡猪肌纤维纤细，纹理间脂肪分布丰富均匀，肉质细嫩，肉味鲜美，是北京奥运会唯一指定猪肉产品。根据营养需要推荐饲养标准配制日粮，测定肌肉常规成分、氨基酸、脂肪酸和矿物元素，发现宁乡猪肌肉内脂肪为5.37%，风味氨基酸高达220.5%，必需氨基酸高达122.4%，油酸(18:1)51.0%，亚油酸(18:2)7.74%，不饱和脂肪酸59.6%，是与深海鱼油媲美的保健食品。宁乡猪和三元猪鲜味氨基酸、必需氨基酸和氨基酸总量差异不显著［1，13］。目前开展了宁乡猪与商品瘦肉型猪生长激素基因功能比较研究，王文策等选用了融合表达载体构建宁乡猪生长激素的原核表达质粒，成功构建重组原核表达质粒pET-GH。
1.5遗传学特性研究发现宁乡猪二、四、六月龄时体重变异系数均在16.28%以上，体长、胸围、腿臀围变异系数为5.66%～8.55%。宁乡猪的体长与胸围的遗传相关系数为0.43，表型相关系数为0.74，这与宁乡猪属于脂防型猪种、具有边长边肥的特点有关。宁乡猪头长、额宽、腿臀围、体高具有高遗传力，头长、额宽表型变量受环境偏差的影响较小。宁乡猪的变异系数较小，产仔数、产活仔数、初生重、泌乳力、断奶重等性状的变异系数较大。宁乡猪毛色是品种特征和遗传稳定性的标志;与瘦肉量相关系数最高的是后腿重。研究发现TLR6基因片段MspI酶切位点的两种等位基因T/C的频率分别为0.186/0.814，TT基因型个体显著影响4月龄体质量性状，TT基因型4月龄体质量比CC型高25.92%;TT基因型个体显著影响45日龄体质量、6月龄体质量、体长和胸围性状，TT基因型45日龄体质量比CC型高12.46%，结果提示宁乡猪TLR6基因不同基因型对生长性状有着重要的影响，是宁乡猪育种应用中的一个潜在遗传标记。
2实验宁乡猪在生物医学研究领域中的应用
2.1实验宁乡猪应用于医学研究的优点研究显示灵长类、犬、猫等在动物实验研究中受到伦理限制，而猪被认为是研究人类疾病最合适的实验动物。既经济实用，又克服了同种器官的短缺。猪心血管系统的解剖、生理特征和对致动脉粥样硬化食物的反应与人类高度一致，成为心血管疾病研究的标准模型动物;猪肾脏的解剖和生理功能几乎是人类的复制品;猪也是皮肤和整形外科手术、皮肤烧伤等较理想的模型动物;小型猪还是皮肤黑色素瘤研究的首选实验动物。刚出生的或剖腹产得到的仔猪，是进行抗原抗体反应很好的模型动物，小型猪也是人类异种移植理想的组织、器官来源，可作为异种移植排斥反应的模型。
2.2实验宁乡猪在生物医学研究中的应用最近研究发现原代宁乡猪与其第一代仔猪13项血液生理指标如白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞积压及部分血液生化指标如总胆红素、尿素氮、总蛋白等有显著性差异，为宁乡猪实验动物化研究提供了参考数据。研究发现宁乡猪与人N-乙酰谷氨酸合成酶氨基酸序列同源性高达93.2%，与小鼠同源性达90.76%，为内源性精氨酸的营养调节提供一个新的途径。赵拴平等发现宁乡猪的总蛋白、三酰甘油、尿素氮、葡萄糖等血液生化指标都处于人参考值范围内，碱性磷酸酶、总胆固醇均高于人参考值范围。耿梅梅等还发现，门静脉灌注葡萄糖可使宁乡猪血糖短期升高，白蛋白、低密度脂蛋白及α-淀粉酶活性下降，经机体代谢，上述指标逐渐恢复，但尿素氮、高密度脂蛋白、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的活性基本无变化。研究还发现宁乡猪与瘦肉型猪相比有不同的代谢，包括脂肪生成、脂质过氧化、能源利用和分区、蛋白质和氨基酸代谢、胃肠道微生物的发酵，肥胖宁乡猪可能是儿童肥胖研究的有用模型，也可能是研究动脉粥样硬化、糖尿病有利模型。宁乡猪完整线粒体基因组序列为有关遗传机制的进一步研究提供重要数据，但研究还表明宁乡猪可能不宜作为异种移植的适当供体。
3展望
关键词：医学实验动物学；教学内容；教学方法；考核评价机制
中图分类号：G424文献标识码：A文章编号：1674-9324（2018）02-0272-02
高等医学院校《医学实验动物学》是硕士研究生必修课程之一，它是进行基础医学研究的基本课程。据相关调查显示，生物学和医学中60—70%的课题要选用合适的实验动物进行相关研究；而药理学、生理学、病理学实验和外科学实验等超过70%科研研究领域需要实验动物参与实验[1-2]；此外，实验动物广泛应用于教学培训、医学研究、药品、生物制品、食品等功能及安全性评价领域[3-4]。实验动物学作为一门独特的学科对生命科学领域研究起着越来越重要的作用。
《医学实验动物学》课程如此重要，因此，如何做好這门课程的教学工作给授课教师提出了更高的要求。结合近年来实验动物在使用过程中出现的一些问题，我们对动物实验课教学从调整教学内容、改进教学方法、改革考核方式等方面做出相应的改革。经过两轮的教学改革取得了良好的教学效果，充分调动了学生学习的积极性和求知欲，培养了学生严谨、科学的学习态度，切实提高了学生的基本操作技能，激发了学生学习的主动性，培养了从发现问题、分析问题到解决问题的科学研究思路，增强了团队协作意识及能力，全面调高了研究生教学质量。在此，我们结合近2年对硕士研究生《医学实验动物学》的教学改革情况，对我校遵义医学院珠海校区本门课程的教学进行相关教学总结，希望进一步促进医学实验动物学教学改革。
一、优化教学内容，理论与实验整合优化
摒弃“灌输式”教育模式，将20学时的理论教学降至16学时。我们充分利用学校研究生网络教学平台、理论课程其他相关教学内容课件以“学习笔记”形式进行网络教学。我们将教材中所列10个章节理论教学分为五大专题进行教学：专题一，实验动物在生命科学领域重要作用；专题二，动物福利与动物伦理；专题三，实验动物基本操作技术；专题四，人类疾病动物模型；专题五，基因工程动物与转基因动物的建立。这五大模块从不同的角度展示了作为医学生应具备的基本知识。而实验教学内容，则由16学时增为32学时，实验教学将分为基础性实验、综合性实验和设计性实验这种“三步法”教学来与理论相呼应，进一步将理论融入到实践中，在严格遵循“3R”原则的前提下提高学生的动手操作能力。我们本着“不放弃教材，但不局限于教材”的原则，根据专题实验的需要，精选教材中相关的章节进行讲述；对于教材中没有及时更新或没有详细阐述的部分，借助互联网资源进行适当补充，做到有的放矢。
二、采用多元化教学方法
我们采用视频教学、PBL教学和网络教学平台相结合的多元教学方法。首先，在实验教学过程中贯彻实验动物福利“3R”原则和动物伦理观，规范实验操作。实验课中倡导和强化实验动物福利伦理观念是实验动物学教学改革必不可少的环节之一，将动物福利观落实到具体实验操作如抓取、保定、给药、采血、处死等各环节中，善待动物，及时制止并纠正学生不规范操作，对于虐待动物者给予批评警告并纳入期末成绩考核。
其次，我们在教学中部分专题还引入“PBL”教学模式，以学生为主体，以问题为中心，在教师的整体把握和指导下，强调学生的主动参与[5-6]。比如，在动物福利这个专题中，我们引入“如何理解动物福利”、“动物解放表现在哪些方面”、“道德进步与动物福利的关系”、“我们在实验中应该如何合理对待动物”以及“动物应激反应与实验结果关系”等问题，通过实验操作及实验体会分组进行相关讨论，并写出相关汇报，以加深对动物福利的理解与认识，通过“问题式探讨”激发学生学习兴趣，增强其自主查阅文献、收集资料等能力。学生是教学中的主体，是教学最终成果的体现者，只有保证学生成为这样的角色，才能实现最终的教学目的。教师角色也发生了转变，由知识的传授者、灌输者、知识权威、教学中心，转变为教学活动的组织者、引导者、参与者和研究者，这样，在教与学的矛盾中，才能促使教师成为创新教学的主要方面，使其正确地把握创新教学的方向。
此外，我们还利用网络资源及购买的实验教学视频进行直观教学，参考资料有武汉大学实验动物中心录制的“实验动物”；国外动物福利组织提供的“共享世界”；国家卫生部录制的“动物基本操作技术”、“动物模型基本病理过程”、“显微注射法建立转基因动物”；钱永祥与梁文道关于“动物伦理与道德进步”的学习视频等。多元化教学方法的应用使教学过程形象化、直观化，达到了文字语言描述难以达到的效果，便于学生进行观察和思考，利于学生分析问题和解决问题。
三、构建合理的考核评价机制
我们根据学生实际情况，制定评价考核表，从规范操作动手能力评价、创新能力评价、团队合作能力评价、科研写作能力评价等方面进行考核[7]（参考表1）。通过实验考核评价体系综合评定学生学习能力，符合大部分学生的意愿，同时培养了学生独立思考问题的能力。其次，请专家组老师深入课堂进行教学评估。最后在课程结束后进行相关问卷调查（表2）。调查结果显示：98%的同学认为教学改革有助于提高其实验操作技能和科研能力，能提高其分析问题和解决问题的能力；95%的同学认为可以激发其兴趣和主动性，增强其团队协作能力；94%的同学认为教学改革拓宽了他们的知识面；100%的同学对教学方法满意，认可教学改革。改革也仍有需要改进的方面，比如，锻炼学生的表达能力和写作能力，以及增强师生间互动这三方面体现得不是很好。今后将寻求可行的方法提高以上几个方面的效果。
四、结语
通过对《医学实验动物学》课程中理论与实验学时的整合优化，使理论知识与实验内容更加紧密地结合，有助于学生对知识理解的融会贯通，学生也更能从动物的角度考虑它们应享有的权益，从心里油然而生一种敬畏之情；通过对实验内容的适当扩充，形成相对完整的专题，增加了动手操作机会，培养学生整体的科研思维观和全面的实验操作协调能力，掌握基本科研思路从发现问题、提出问题到设计实验、解决问题四步法着手去构建科研课题研究框架；通过多元化教学方法激发学生学习兴趣和提高其自主学习能力，兴趣和主动性是科研的开始；通过完善的考核方式更合理地从学习态度、创新思维、动手操作、团队协作及自主学习5大方面衡量学生的综合能力，促进学生个性化发展，同时有利于充分提高该课程研究生教学效果。另外，通过解决和应对专题实验教学中出现的新问题，提高任课教师的整体素质，促进实验动物学课程的建设和完善。我们也希望能在不断进行教学革新基础上，申请教改项目来引入更多实践教学，构建合理的课程体系，在更大程度上促进实验动物学的课程建设和发展，进一步推进产学研一体化，培养出真正合格的研究生。
作者：张青峰
参考文献：
[1]崔淑芳，陈学进等，实验动物学[M].上海：第二军医大学出版社，2013.
[2]师长宏，张海，王四旺等.三维医学实验动物学教学体系的建立[J].基础医学教育，2012，14（4）：289-291.
[3]王芳.医学实验动物学实验教学与科研的有机结合[J].基础医学教育.2013.（11）：1016-1018.
[4]宋国华，刘田福，陈朝阳，王春芳等.医学实验动物学教学内容与方法的探讨与改进[J].基础医学教育，2012，（10）：781-783.
[5]王萧，郭学军，张永斌.中医院校研究生实验动物学教学的体会与思考[J].西北医学教育，2013，21（1）：76-78.
1 动物替代研究概论
1.1 概念
动物替代研究又被叫做非动物研究，具体是指使用替换活体动物的方法，实现生命科学和相关的研究来验证实验目的。动物替代的研究理论为三R原则，即替代、减少、优化[1]。主要内容有：减少对于动物的使用数量和使用时间；使用非动物模型代替动物模型；优化动物的运用方式，减少动物不必要的疼痛和不适应。
1.2 动物替代的分类
按研究范围进行划分，动物替代主要有两个方面：动物检测替代和动物使用替代。第一，动物检测替代。在应用程序方面，使用体外检测的方式替代之前动物整体的检测方式，如组织人员进行技术培训或使用数学模型等，积极提倡在科学研究或者实验室试验的过程中代替动物检测的方式。第二，在研究、檢查和授课中灵活运用代替动物的方式，来获得同样的目的。实验动物替代的层次可划分为不同等级：一是非生物替代，是指运用数理化和计算机等方式替代；二是发育程度低的动物替育高的动物，如使用昆虫等小型动物代替；三是减少型替代，减少对于实验动物的使用时间和次数；四是优化型替代，如果必须要使用动物来进行试验同时还没有其他的方法时，就需要优化实验过程，将动物从开始的运输到埋葬尸体结束的全部过程。
1.3 动物实验替代法的准用程序
想要使用一种新的实验方法，需要经过建立到审批的全过程。第一，替代法的建立需要有一个完整的替代构架以及应用价值；第二，优化研究方法，可以很好地探测到实验物体内的生命体征；第三，进行多个实验验证，即在不同的时间、地点使用替代法的实用性、可靠性和重复性；第四，同行评价，独立评价替代方法的实用性、可靠性和重复性；第五，将新的实验方法上交国家审核，按照相关的规定审核，通过后才可以使用。
1.4 替代法的必要性
对于动物的替代研究，在社会中具有多方面的价值。第一，动物替代法满足人道伦理的发展需要；第二，大大减少了实验过程中动物的经费；第三，使医学实验授课向更人性化的方向发展；第四，将实验变得更加合理，还能与人类疾病相接近，避免实验动物的不确定性，促进医学研究的发展。
2 国外动物替代研究起源和发展现状
2.1 国外动物替代研究发起源
国外的动物替代源自于英国，并最早提出三R原则，当时被认为这个领域的代表。二十世纪七十年代，英国的基金协会在传播3R原则中作出了巨大的贡献。在2013年，英国首个教育和研究合作组启动，呼吁科学家们一起寻找动物替代法，为了能够符合常理和治疗措施等的实验方法，这件事情被医学界视为重要的里程碑。
2.2 机构建立
全球的替代研究组织多位于英国、美国和欧洲发达国家、地区。根据毒性测试非动物方法网站ALTTOX的更新消息，截至2015年，欧洲替代研究机构一共有47个[2]，主要分布于英国、德国、荷兰、法国、意大利和比利时等多个国家。美国的替代研究机构有24个，亚太地区和南美等国家动物替代机构位于澳大利亚、巴西、加拿大、日本、韩国。
2.3 人性化的替代
欧洲的人性化教育网络建立于1988年，在2000年变更成国际人性化教育网络，提倡爱护广大人士，在生物科学、医学兽医教育学中对于动物使用替代的方法。美国的国家反活体解剖学会一直致力于建设爱护生命，尊重世界，禁止科学界滥用动物的实验。
2.4 出台相关的法律
2007年欧盟对于化学品实施了监管系统，名为《化学品的注册、评估、授权和限制》，简称REACH法规。其宗旨是保护人类健康和环境的安全，研制无毒无害化合物的创新能力，增加化学品的使用透明度，促进非动物实验，追求可续发展的要求。欧盟是第一个禁止化妆品动物实验的地区，随后巴西等国家也借鉴欧盟的法律制定了相关的法律。
3 我国动物替代研究现状
通过对相关文献的查找，在知网中搜索有关研究的信息，并结合相关的法律、医学方面的教育和替代研究方法的文献，对其急性定性描述概括。对于替代方法的研究主要包括以下几点内容：毒理学检测、化妆品毒性检测、眼刺激实验替代方法；动物模型的替代，和体外实验替代动物的整体实验；药物反应和动物实验授课等。
广州在2010年成立了中国替代方法研究评价中心，并建设了网站，为中国的替代法技术和研究信息的传递提供良好的交流桥梁，其中最主要的目的是：第一，宣传、普及、分享、推广3R理念和动物替代方法；第二，对于科学家的实验起到间接的帮助作用；第三，网上咨询有关动物替代的内容；第四，推广3R原则，让大众了解和认可3R技术，对于体外实验方法的交流和研讨；第五，使得国内外的各医学动物替代研究所可以良好地交流和沟通，还能从中吸取经验和技术。2007年，北京实验动物学会建立了实验动物替代法研究会，同时还设立了杂志栏，为人们介绍外国实验室的3R研究技术和在各种学术中的灵活使用。
4 结语
动物替代的研究随着时代的进步在不断地发展和进步，尤其是关于一些细胞等相关的研究在计算机的辅助下进行，之前的活体动物研究现如今都可以使用体外的方法试验。我国的一些实验室和相关的研发人员在生物制药和研发等实验都进行了深入的研究，但和发达国家相比，研究的内容相当有限，这种替代方法仍处于逐渐摸索的阶段，在各个方面都有些落后于发达国家。
为了发展我国的替代方法，可以借鉴国外先进的研究组织或者管理方面的知识和技术，还要成立医学动物替代法的研究机构，方便各方信息的传递。同时还要鼓励动物替代实验的方法的讨论和教育，建立相关的动物替代实验课程视频和书籍等，但是要保证医学生的替代解剖课的权利，推广使用非动物的实验法，使我国的科学研究有一个良好的发展方向，为人类、动物和大自然提供良好的生存环境。
参考文献
[1]卫茂玲.医学动物替代研究发展现状研究[J].中国医学伦理学，2016，29（2）：304-307.
[关键词]野生动物医学 野生动物保护 兽医学 疫病防治
[中图分类号] G643 [文献标识码] A [文章编号] 2095-3437（2015）11-0129-02
野生动物医学不是一个独立的学科，它是兽医学和野生动物保护学的一个交叉学科，以野生动物为研究对象，以野生动物疾病防治为研究内容。野生动物医学在我国作为一个新兴的交叉学科，其研究生的培养还没有形成自己的独立体系，在国务院学位委员会颁布的学科目录中还没有野生动物医学这个学科。野生动物医学研究生的招生培养需要借助野生动植物保护与利用、生物学等学科平台进行。
一、野生动物医学方向的研究生将成为野生动物疫源疫病防控和野生动物救护领域的研究型或者综合型人才
野生动物医学的研究生教育是对动物医学、野生动物保护专业的本科生在野生动物疾病研究基础上作更高层次的培养。动物医学本科专业的学生在大学期间主要学习的是动物疾病防治方面的基础知识及其在动物疾病防治方面的初步应用，对于野生动物保护相关的知识内容学习得并不深入。野生动物保护本科专业的学生在大学期间主要学习野生动物保护、自然保护区管理方面的一些基础知识，对野生动物疾病方面的知识只作一个大概的了解。而野生动物医学的研究生就在要在研究生学习阶段将这两个不同专业体系的知识有机的融合在一起，培养既熟悉动物疫病防治理论又掌握野生动物保护知识的跨学科体系的研究型或者综合型人才。
研究型野生动物医学研究生侧重对野生动物疫病发生发展规律的研究，在对病原体特征进行深入研究后，结合发病野生动物的行为特征，提出疫情、疫病防控的综合措施。该类型的研究生要重点培养其创新意识和创新精神，为将来野生动物疫病防治领域基础研究做人才储备。野生动物医学研究型研究生可按照科学硕士进行招生培养，鼓励他们继续进行博士学习，并最终将野生动物疫病研究作为其终生的职业。
综合型野生动物医学研究生要以野生动物保护具体工作单位或者特种经济动物养殖行业的需要为培养出发点，通过自身的专业知识和操作技能，提高基层野生动物保护工作者或者特种经济动物养殖者的业务水平，提升动物疫病防控和野生动物救护能力。该类型的研究生要重点培养其组织协调和解决实际问题的能力。野生动物医学综合型研究生可按照专业学位硕士进行招生培养，要创造条件让他们多与相关生产实践单位接触，了解相关生产实践单位在动物疫源疫病防控和野生动物中遇到的问题，有目的开展相应的研究试验，以便将来在工作中解决这些问题。
二、野生动物医学研究生人才的培养
（一）对于研究生的培养，不再以教师传授基本的学科知识为首要任务。研究生授课体系应该具有培养学生的专业理念素养、自主获取知识的功能。对于野生动物医学研究生，应将科学的野生动物保护观根植于心，熟悉国际、国内野生动物保护行业的现状，使学生明白其从事的科学研究工作是服务于野生动物保护、改善生态环境、提高人民生活质量这个根本的大局，有着重要的政治、经济、人文意义。
（二）野生动物行业有其特殊性，在进行野生动物相关工作的时候会受到相关法律法规的约束。作为野生动物高级人才，野生动物医学的研究生一定要熟悉与野生动物相关的国际、国内法律法规。适用我国野生动物和利用的法律法规有《国家重点保护野生动物名录》《有重要经济价值和科学研究价值的野生动物名录》《中华人民共和国野生动物保护法》《中华人民共和国陆生野生动物保护实施条例》《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国进出境动植物检疫法》《中华人民共和国进出境动植物检疫法实施条例》《中华人民共和国进出境动物一类、二类传染病》《进境动物和动物产品风险分析管理规定》《濒危野生动植物种国际贸易公约》。
（三）野生动物医学研究生需要结合兽医学和野生动物保护学两个学科体系的知识进行培养，需要建立跨学科的课程体系。在培养野生动物医学研究生的过程中，课程体系应该围绕“野生动物疾病防治”这个核心点，建立“兽医学”和“野生动物保护”这两个课程模块供学生选择。本科为动物医学背景的同学应该选择“野生动物保护”这个模块中设立的课程，本科为野生动物保护背景的同学应该选择“兽医学”这个模块中设立的课程。但无论是“兽医学”还是“野生动物保护”模块中的课程体系，都不能简单的照搬各自本科专业的课程设置模式，也不能采用本科阶段的授课方式。
研究生要重点培养其自学能力，在课程设置和授课过程中不需要全面系统的讲述，只需要给学生点出各种课程核心内容即可，按照“师傅领进门，学艺靠个人”的观念进行授课。“兽医学”模块体系，可借鉴兽医学一级学科的分类法，分为基础兽医学、预防兽医学、临床兽医学三大综合课程。“野生动物保护”模块设置野生动物管理学、生态学、动物学这三大综合课程。
基础兽医学重点讲述怎样应用生理学、病理学、药理学知识阐述发病机制，诊断具体疾病，指导用药施治，通过例证法使学生掌握这几门课程的用途即可，而这几门课程系统的理论和概念，包括解剖学、组织胚胎学可由学生根据实际情况自学。
预防兽医学重点讲述病原体（微生物、寄生虫）在传染性疾病发生过程中所起到的核心作用，可通过几个重要的疾病如禽流感、血吸虫病对野生动物及人类自身的影响来讲述。
1适配体及其优点
适配体的概念在1990年由Tuerk等首次提出,来源于拉丁语“aptus”,即“匹配”的意思,指能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸片段。研究表明,在一定环境下,单链DNA或RNA能与某些物质形成多种热力学稳定的三维空间结构而成为各种功能分子。在大多数情况下,溶液中的单链DNA或RNA的空间构象是不确定的,当有目标分子存在时,在合适的环境下寡聚单链会发生适应性折叠,形成发夹(hairpin)、假结(pseudoknot)、凸环(bulge)、G-四分体(G-quartet)等特殊结构,通过氢键、疏水堆积作用、范德华力等与目标分子紧密结合[1]。研究者们在单链DNA或RNA自身形成的空间结构与目标分子高效特异结合的基础上,建立随机寡核苷酸文库,将该库中的核苷酸序列与目标分子混合,用洗脱、过滤、亲和色谱、磁性微球等方法筛选出与其特异性结合的核苷酸片段,再通过PCR进行扩增,经多个循环分离得到亲和力和特异性都最高的寡核苷酸结合序列[2]。筛选出的寡核苷酸片段被称为适配体,与适配体能进行特异性结合的目标分子称为配体(ligand)。
与传统抗体相比,适配体具有以下优点。①靶标广。适配体可以与小分子物质如氨基酸、金属离子、辅助因子FMN、核苷等结合,也可以是药物、类固醇、糖类等,甚至是完整的细胞、病毒和细菌等结合,拓宽了其应用范围。②有高亲和性和特异性。
核酸适配体只识别与其互补的分子空间结构,能够分辨出靶分子结构上的细微差别,比如相差一个甲基或一个羟基或D/L镜像体之间的区别等。同时核酸适配体与靶分子结合的解离常数(kd)可以达到纳摩尔甚至皮摩尔水平,具有比抗体或其他类型配基更高的亲和力和特异性,有的甚至高于天然配体[3],几乎可以完全避免非特异性结合。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似,常规的茶碱单抗与后两者有交叉反应,而核酸适配体只特异结合茶碱,与其他两种物质无反应,且与茶碱的亲和力比与咖啡因高10000倍。③可以大量、快速地在体外合成,筛选制备简单快速,结构易改造与修饰。2001年Cox等[4]成功地建立了适配体自动化筛选平台,筛选到了溶菌酶的适配体。筛选流程包括:通过链霉亲和素(SA)与生物素的相互作用将生物素化的靶蛋白固定在磁珠上,随后特异结合序列的分离,RT-PCR扩增和转录都通过设定的程序自动化完成,最后将筛选得到的序列克隆到载体中进行测序鉴定。2002年又做了进一步改进[5],直接利用基因体外转录与翻译的方法产生靶蛋白。④稳定性优于抗体,利于储存。核酸适配体在亲和力和特异性方面可与抗体媲美,甚至优于抗体,并且具有抗体所不具备的其他一些优点[6]。⑤具有低免疫原性,能干扰靶蛋白质之间的相互作用。核酸适配体不具有免疫原性,预临床试验结果显示,即使应用剂量高于治疗剂量的1000倍[7],也不会引起免疫反应,没有明显的毒性和副作用。
2适配体的研究现状
2.1治疗药物的选择
理论上,适配体可以被用于治疗任何由有害基因的表达而引起的疾病,如病毒感染、癌增长和炎性疾病等。核酸适配体作为治疗药物的研究始于20世纪90年代,首先被证明具有治疗功能的适配体是抗血管内皮生长因子适配体,也是适配体治疗药物中最成功的一例,后来被EyetechPharmaceuticals公司和Pfizer公司共同开发为一种治疗湿性老年性黄斑变性药物,已经通过第三阶段临床试验[8]。
此后,适配体作为治疗药物在生物医学领域得到了广泛推进,并深入到各个领域,如心血管疾病治疗、肿瘤的显像和治疗、流感病毒的检测和治疗药物等各个方面。近年来,核酸适配体类抗病毒药物的筛选研究进行得尤其迅速,如通过筛选抑制A20蛋白适配体来抑制牛痘病毒的复制[9],丙型肝炎病毒RNA复制子的适配体的筛选[10]及抗HIV药物筛选等。其中,对抗HIV适配体类药物的研究最多,如Kissel等[11]通过抑制HIV-1逆转录酶制备的适配体、Hannoush等[12]通过抑制HIV-1核糖核酸酶H制备的适配体及Katahira等[13]通过抑制HIV-1Tat蛋白介导的反式激活制备的核酸适配体等。
2.2小分子物质检测
人们设计出各种新型的生物传感器来检测金属离子、药物、核酸、蛋白质和细胞等小分子物质,并通过荧光染料、荧光共轭高聚物、纳米粒子、电化学活性探针等材料以及核酸的级数扩增特性、核酶的催化活性及镜像适配体的手性识别特性等多种形式增加检测灵敏度。基于适配体的检测技术也令人振奋,如荧光染料TOTO常温下直接与适配体混合即完成“标记”而用于靶分子检测[14],基于适配体的生物传感器可达到“无试剂、可再生、超敏感”的靶分子检测新要求[15]。McCauley等[16]以核酸适配体制成生物芯片,能同时、定量、特异地检出3种混于血清和细胞提取物中的肿瘤相关蛋白(次黄嘌呤单磷酸脱氢酶Ⅱ、血管内皮生长因子和碱性成纤维生长因子),显示出良好的特异性和应用前景。
目前已开发了基于适配体的比色、荧光及电化学等方法,用于各种疾病相关蛋白质的检测。Wang等[17]利用硅纳米颗粒与金电极技术结合,将适配体应用到电化学生物传感器上,采用竞争模式对凝血酶蛋白进行了定量检测,检测限可达1.0×10-12mol/L。2006年我国徒永华等[18]利用凝血酶的2条核酸适配体与凝血酶的高亲和力构建了三明治结构,利用磁性纳米颗粒的磁性分离技术,设计并制作了一种新型的荧光纳米生物传感器,用其检测凝血酶,具有很高的特异性和灵敏度。由于目标分子在适配体上精确的结合位点与构象变化通常并不十分清楚,直接导致合适标记核酸适配体存在一定的难度。因此,适配体的无标记型检测技术已经成为近年来的研究热点,尤其在生物检测、环境监控等领域具有非常重要的意义。
2.3基因调控领域
适配体可通过与靶位点结合而影响生物体的遗传功能,适配体可以直接在转录和翻译两个水平上对基因表达产物进行调控。适配体通过对构成表达体系中的各类因子的作用,抑制或激活调控蛋白的活性来影响mRNA或蛋白质的表达量。或将适配体作为调控元件插入到表达体系中,通过适配体与靶分子结合时的变构效应,影响蛋白质最终表达,从而对蛋白质的功能进行调控。LXRs是肝中胆固醇逆向转运调节的一种重要因子,它通过干预机体内众多胆固醇调节蛋白的表达量来调节血液中胆固醇代谢。Surugiu-warnmark等[19]通过体外筛选技术筛选到一种LXRs受体抑制剂,该适配体能有效地降低LXR-α和LXR-β受体浓度,通过控制脂肪酸的合成和高密度脂蛋白的组装来调节胆固醇的合成。该适配体是一种潜在的治疗动脉粥样硬化心血管疾病药物。Charlton等[20]利用适配体结合中性粒细胞中弹性蛋白酶从而阻止其催化反应,其作用超过了此蛋白酶的天然抑制因子。而可识别凝血因子Ⅸa的RNA适配体在临床中已可替代肝素,并可通过适配体的互补序列来调控抗凝效果[21]。最近人们开发出一些与肿瘤、艾滋病、肝炎相关蛋白质的适配体,可直接用于干扰疾病的发展过程[22]。原核生物中发现的Riboswitch更是适配体参与基因表达调控的一大里程碑,该发现提示不需要蛋白质因子的参与,RNA与代谢产物结合即可调控自身的转录和/或翻译。根据这一原理,人工构建的Ribos-witch能够实现目的基因的可调控表达[23],利用Ri-boswitch特性有可能开发出新型抗生素。
3适配体在动物医学领域的应用前景
3.1动物疫病治疗中的应用
适配体在治疗动物疫病方面的研究还处在起始阶段,近年来在病毒性疾病、细菌性疾病和寄生虫病治疗方面都有了初步探索结果。病毒性疾病方面,Cheng等[24]利用SELEX技术筛选出与H5N1亚型流感病毒HA1蛋白结合的DNA适配体,对H5N1亚型流感病毒具有抑制活性;Jang等[25]在体外筛选出抑制人严重急性呼吸综合征病毒(SARS)NT-Pase/解旋酶的RNA适配体,通过抑制该病毒双链DNA的解旋来抑制病毒复制。King等[26]以纯化的朊病毒蛋白质作为靶物质,筛选到了适配体97,试验证明该适配体在脑组织匀浆中能特异性地识别和结合朊病毒蛋白质。细菌性疾病方面,江丽等[27]筛选到了与葡萄球菌肠毒素B(ESB)特异、高亲和力结合的单链DNA(ssDNA)适配体,为金黄色葡萄球菌感染的诊治奠定了基础;潘勤等[28]筛选出了针对伤寒杆菌IBV型纤毛操纵子的适配体,该适配体能显著抑制伤寒杆菌侵入THP-1细胞。这些研究成果使得开发新型预防和控制动物传染病感染的药物成为可能。
此外,在寄生虫病的防治方面,也有人进行了初步研究。非洲布氏锥虫是人与家畜易感的致命的寄生虫病的病原,目前所使用的药物毒副作用大,且存在耐药现象。Homann等[29]构建了85个核苷酸的RNA序列文库,得到了3个家族的抗布氏锥虫适配体。其中,适配体2-16能折叠形成假结发夹结构并能够与血流阶段的布氏锥虫结合,亲和力达到6·0×10-5mol/L。这不仅对寄生虫病的治疗方法进行了探索,还为适配体用于活组织或其他复合物表面成分的鉴定及定位提供了依据。
3.2动物产品检验中的应用
