时间：2023-06-06 15:45:29
序论：在您撰写干细胞培养技术时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
近年来，人类组织干细胞的研究已成为国内外学者关注的焦点，表皮干细胞即是其中之一。表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[1]。随着人口老龄化速度加快，慢性溃疡及皮肤病患者日益增多，加之烧伤及意外创伤造成的皮肤缺损，临床对皮肤移植的需求越来越大。由于表皮干细胞数量少，缺乏明确的特异性分子标志，体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，增加了分离培养的难度。获得大量高纯度的表皮干细胞成为该领域研究的关键技术。我们根据几年来在细胞培养方面的工作实践，将人表皮干细胞的培养技术总结如下。
1 人表皮干细胞的分离与培养
应用IV型胶原快速粘附法从手术切除的人包皮组织中分离表皮细胞中的快速粘附细胞，这一群细胞被认为是表皮干细胞，它具有快速粘附、缓慢生长的特点[2]。取年龄在5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片，无菌条件下去除皮下脂肪层，用含青霉素、链霉素的PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小约0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培养皿中，加入0.25%中性蛋白酶10 ml，4℃消化l4～16 h，吸弃上清，分离表皮和真皮层。剪碎表皮，用0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网研磨过滤。滤液经1 000转/min离心10 min，弃上清，收集细胞。加入表皮干细胞培养基(每100 ml KSFM培养基加入0.05 mmol氯化钙100 μl、HKGS添加剂1 ml)并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37℃孵育15 min。倒置镜下观察，粘附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，吸出细胞悬液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干细胞培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长，2～3 d内细胞开始分裂，4～5 d后会出现许多细胞克隆或集落。培养基中钙离子的浓度是保持人表皮干细胞既增殖又不分化的关键。钙离子浓度过低，会导致所培养的人表皮干细胞生长缓慢或不生长;若钙离子浓度过高，则加速了细胞分化。我们在实验中筛选出适合的培养基中钙离子浓度，可以保证有效的培养维持。在培养过程中，还要经常检查培养箱温度和CO2的浓度，过低或过高的温度和CO2含量都影响人表皮干细胞的生长，容易出现细胞老化和衰退现象。为了避免各种细菌、真菌污染培养箱，每周用75%的酒精擦洗箱内的托盘、格架、箱壁。托盘始终装有一定量的饱和浓度磷酸氢二钠(Na2HPO4)液体，细菌既不能在其中生长，也能提供合适的湿度[3]。
2 人表皮干细胞的传代
当原代细胞达到70%～80%融合时，需进行传代，否则细胞会没有足够的生长空间，也会因为营养耗竭而影响生长[4]。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞，置37℃温育5 min，必须经常在显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞部分漂浮起来，即可终止消化。加入2 ml终止液，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，按1∶2传代。传代细胞接种于IV型胶原预铺的培养瓶中。
3 人表皮干细胞的冻存
细胞不用或保种时，可将细胞冷冻保存在液氮中。细胞在培养基中直接降温冷冻，可因细胞内、外环境中的水而形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、渗透压改变、蛋白变性等，从而引起细胞死亡。因此，细胞培养基中要加入保护剂二甲基亚砜(DMSO)或甘油。为保持细胞最大存活率，冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。一般用第2代人表皮干细胞培养至对数生长期时，用含胎牛血清的DMEM培养液将细胞配成5×106 /ml 的细胞悬液，1 000转/min，离心10 min，弃去上清，加入1～2 ml 含有10%DMSO的冻存液，用吸管小心吹打，重新悬浮细胞，分装于2 ml冻存管中，将盖拧紧，用记号笔记好细胞名称、细胞代数、冻存日期、操作人等。放入-70℃冰箱过夜后，再转入液氮罐中保存。注意：用于冻存的细胞应在光镜下观察生长状态良好，冻存细胞的体积不要超过冻存管体积的1/2。
4 人表皮干细胞的复苏
从液氮中取出冻存管后，迅速投入预先准备的40～42℃水中，并不时摇动，让细胞冻存液快速解冻1 min左右。取出冻存管，用75%酒精擦拭消毒外壁后，吸出细胞悬液，加至10 ml离心管中，补加含胎牛血清的DMEM培养液，小心吹打使细胞分散悬浮。1 000转/min，低速离心10 min，弃去上清，加入表皮干细胞用的条件培养基适当稀释后，转入IV型胶原预铺的培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和水蒸汽培养箱中培养。复苏后要每天观察细胞状态，待细胞生长至适当密度时，及时分瓶培养或实验待用。
人表皮干细胞培养技术发展迅速，但诸如细胞在体外培养容易变形，多次传代后细胞克隆形成率明显下降，细胞逐渐分化难以保持原代细胞特性等问题，还有待更好地解决。
参考文献
1 Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al.Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro: keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites，and their number varies with donor age and culture stage.J Cell Sci，1996，109 (Pt 5): 10171028.
2 Kim DS，Cho HJ，Choi HR，et al.Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents.Cell Mol Life Sci，2004，61(21): 27742781.
目的： 利用简化无血清培养基和连续传代法，从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs)，观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点. 用p75， GFAP，Peripherin，αActin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系. 方法： 将新生1， 5 d的小鼠肠管制成单细胞悬液，接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养，连续传代培养并观察克隆球的形成过程. 将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中，观察其分化现象. 用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达. 结果： 成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球. 免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞. 结论： 成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs，在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.
【关键词】 肠神经嵴干细胞 小鼠 细胞培养技术 细胞分化 Hirschsprung病
0引言
应用神经干细胞治疗某些神经系统的损伤和退行性疾病，经过较长时间的实践已被证明是行之有效的［1］. 肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神经管背侧，具有干细胞特性［2］，将其用于治疗先天性巨结肠症及肠神经系统干细胞疾病的研究已引起人们的关注，本实验着重进行GNCSCs的基础研究，为临床应用建立理论基础.
1材料和方法
1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，体质量不拘，西安交通大学医学实验动物中心提供. ① DMEM/F12完全培养基（Gibco）组成：B27添加剂（Gibco），N2添加剂（Gibco），重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF， vitrogen)， β巯基乙醇（Sigma），青霉素和链霉素（华北制药）. ② 促分化培养基组成：DMEM/F12完全培养基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ胶原酶（Sigma），左旋多聚赖氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武汉博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗体(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗体（DAKO），鼠抗小鼠αActin单克隆抗体（Sigma）SABC试剂盒、DAB显色试剂盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗为TRITC标记山羊抗小鼠IgG(北京中杉).
1.2方法
1.2.1取材、克隆球的培养颈椎脱臼法处死2组小鼠，将其肠管放入Hanks，清洗，机械分散肠管组织，胰蛋白酶和Ⅳ胶原酶分别消化肠管组织30 min，10 min，终止消化后反复吹打制成单细胞悬液，用200目，400目的滤网过滤，以800 r/min 离心 5 min，弃上清，用预先配置的无血清完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数活细胞，以 6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，添加培养基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，饱和湿度培养箱中水平放置，贴壁培养. 原代孵育24 h后弃去漂浮的死细胞，以2/3量换液，孵育3 d后进行传代，以6×108个/L接种到25 mL培养瓶中，继续孵育40~48 h后再次传代，如有细胞团块形成则以1代/1~2 d的速度传代，3代之后可形成圆形的克隆球.
1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培养基重悬传代5次后的克隆球，接种于放置有预先包被左旋多聚赖氨酸盖玻片的35 mm培养皿内，每皿2 mL，动态观察克隆球的分化情况.
1.2.3克隆球及其分化细胞特异性标志物的染色应用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗体分别检测克隆球及其分化细胞系的性质，封片后分别用光学显微镜和激光共焦显微镜取图.
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2结果
2.1克隆球的生长状况接种初期，倒置显微镜下观察到单细胞和一些呈半球状或不规则的细胞团. 孵育24 h后，贴壁细胞胞呈圆形，胞体小，折光性好，部分贴壁细胞胞体增大，折光性增强，出现分裂相，形成2～5个细胞的细胞团，另一部分呈聚集生长. 3 d后形成十几或数十个细胞构成的克隆球(图1A)，克隆球增大的同时向周围伸出放射状的细胞索，形成较小的次级克隆，这些克隆球形态完整，折光性减弱，周边界线清晰，但其中心密集，界限不清，无法观察到完整的细胞结构 （图1B）. 重新传代培养，可观察到细胞胞体增大，出现分裂相的克隆球数量逐渐增多，杂质细胞减少，在连续传代过程中克隆球逐渐纯化.
2.2克隆球的分化接种含血清培养基12 h后，可见有细胞从克隆球中迁出，迁出的细胞贴壁生长；24 h后克隆球变扁，迁移出的细胞增多，相差显微镜下难以分别形态；48 h后贴壁细胞数量明显增加，逐渐形成单细胞层且细胞形态多元化.
2.3克隆球及其分化细胞系的免疫染色免疫细胞化学方法进行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（图1C，图2， 3）.
3讨论
许多研究表明GNCSCs在ENS的发生和发育起关键作用［3-4］. 目前HSCR的病因与RET等8种基因密切相关［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、迁徙及分化等功能发生障碍，受累肠道的相应神经节出现缺失，表明先天性巨结肠可能是一种干细胞疾病. 由于HSCR及肠神经系统干细胞性疾病在手术治疗后仍遗留有严重的并发症，因此用干细胞来进行临床治疗已成为研究的热点和重点. 鉴于胚胎干细胞的来源限制及免疫排斥问题，成体GNCSCs的研究将为今后的移植试验提供新契机.
GNCSCs的培养方法建立在中枢神经干细胞的基础上. 依据神经干细胞经典的培养方法，再结合GNCSCs“收获率”低、难以分离纯化的特点，联合应用简化的特殊培养剂和神经干细胞培养方法进行体外培养. 连续传10代后，GNCSCs的相对比例明显增加，这种体外培养的方法能有效地分离和纯化GNCSCs，但并不能完全消除其他细胞. 如果继续传代，其纯化程度越高，后续的试验效果将更佳. 连续传代不仅纯化了GNCSCs，还证实了干细胞的自我更新特性. 在体外培养干细胞时，培养条件稍有变化可导致分化机制的启动，因此采用血清促分化法诱导GNCSCs分化既简单又可靠. 通过免疫染色，证实了GNCSCs分化细胞的类型，同时显示了分化的亚型神经元及神经胶质细胞的形态，并表明了成体干细胞的多向分化能力.
参考文献
［1］ 杨帆，杨树源. 神经干细胞研究进展及临床应用前景［J］.医学综述， 2002；8(8):491-493.
［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.
［3］ Natarajan D， Grigoriou M， MarcosGutierrez CV， et al. Multipotential progenitors of the mammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture［J］. Development 1999， 126(1):157-168.
关键词： 大鼠 肌源性干细胞 体外培养
近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。
1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。
2 结 果
2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200
图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200
图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200
图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200
图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400
2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线
2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。
3 讨 论
【关键词】 大鼠 肌源性干细胞 体外培养
Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods
By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions
MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.
Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro
近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照参考文献所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。
1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。
2 结
果
2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200
图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200
图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200
图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200
图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400
2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线
2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。
3 讨
论
近年在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。预期它们在组织工程应用领域特别是细胞移植和基因治疗方面前景广阔。国外已在进行大量MDSCs介导的相关的基因治疗和组织工程的动物实验［6-8］，并取得了较明显的效果。因此建立和完善MDSCs培养方法，获取高纯度的细胞具有重要实用价值。
骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成，在肌膜和基膜之间有一种体积较小的扁平成立方形细胞，称为卫星细胞［9］，是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的单潜能成肌干细胞，这种组织特异性的干细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起重要作用。有证据表明新近发现的肌源性干细胞(MDSCs)是一群与卫星细胞完全不同的细胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞。
lee等［7］31-37从骨骼肌细胞中发现了MDSCs，与卫星细胞相比，其具有更多的分化潜能，不仅能分化成骨骼肌纤维，促进肌组织再生，还能分化成成骨细胞，促进骨骼愈合［5］，被认为是卫星细胞的前体。贴壁前的MDSCs呈小而圆的球形，折光性强，刚贴壁仍为圆形，贴壁后的MDSCs呈纺锤形，延迟分瓶时会融合成成熟的多核肌管，这与成纤维细胞不同。preplate技术利用差速贴壁获取MDSCs，其原理是成纤维细胞、内皮细胞的贴壁能力强于卫星细胞，卫星细胞的贴附能力又强于MDSCs，4 d内即可完全贴壁而此时MDSCs仍处于悬浮状态［6］1085-1100，实验中发现，组织块中加入胶原酶后很快就变成了乳糜状，胰酶对组织具有很好的离散作用，再通过反复吹打可将细胞从基膜中分离出来，得到的细胞为成纤维细胞、白细胞、内皮细胞、卫星细胞及MDSCs的混合物，利用差速贴壁法4 d后处于悬浮状态的细胞移出培养即为纯化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我们通过结蛋白desmin染色鉴定其肌源性，通过其多向分化的能力来鉴定其干细胞特性。实验中我们还发现，随着乳鼠出生天数的延长，所取得的MDSCs的数量和活力逐渐下降，但出生时间太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最适宜进行原代取材。
结蛋白（desmin）是中间丝蛋白的一种，是成肌分化的早期的标志，常作为肌源性的标志，虽然成纤维细胞与骨骼肌内血管平滑肌细胞也产生结蛋白，但此细胞中结蛋白含量低，与抗体产生弱阳性反应，且仅有15％的desmin阳性率［10］，而通过本方法获取的MDSCs中desmin阳性率高达90%，由此可进行初步鉴别。
MDSCs属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。通过对常规技术的改良，本研究建立了一种稳定高效的新生大鼠MDSCs分离纯化技术，并成功对MDSCs进行了鉴定，为MDSCs在基因治疗和组织工程的临床应用打下了基础。
参考文献
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【关键词】间充质干细胞；脂肪组织；细胞培养；SUI模型
【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01
压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。
1临床资料
注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。
方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。
2结果
原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。
3讨论
本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。
结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。
参考文献
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【摘要】
目的： 建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法，探讨神经干细胞的基本生物学特性。方法： 取孕14 d胎鼠大脑皮层，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养和胎牛血清诱导分化， 应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞。结果： 从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白（Nestin）免疫阳性并能在体外传代培养，血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白，诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin。结论： 分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin，并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能，属于中枢神经系统的神经干细胞。
【关键词】 干细胞 大脑皮质 细胞培养 细胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley
［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.
［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley
传统观念认为，哺乳动物的神经组织只有死亡，没有再生能力。自从上世纪90年代初科学家们分离、培养出神经干细胞(Neural stem cells，NSCs）以来，人们相继从各种动物及人的中枢神经系统分离、培养了NSCs[1，2] 。NSCs的发现不仅打破了神经元不会再生的传统观念，而且为许多以往难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗思路和途径。2007年6月利用细胞分离、无血清培养、血清诱导分化及免疫荧光等技术，证明了本实验所分离的细胞群为NSCs，以期为进一步使用和研究NSCs奠定理论及实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F12、B27、胎牛血清购自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗体、突触素抗体Snaptophysin购自SIGMA公司，MAP2抗体、GFAP抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜为NIKON公司产品。
1.2 NSCs的分离培养[3～5]
成年雌性和雄性SD大鼠各1只，体重220～260 g，雌雄合笼后，检查阴栓，见阴栓计为孕0 d；孕14 d时取胎鼠，在解剖显微镜下仔细分离获得胎鼠大脑皮层，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反复切割组织，再用200目细胞筛过滤，收集入离心管中，反复吹打，制成单细胞悬液，经细胞计数后，分装入50 ml培养瓶中，细胞数约为1×106/ml。培养条件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d传代1次。
1.3 NSCs的诱导分化
取第4代传代培养的NSCs，将其吹打成单细胞后，以5×104/片细胞密度种于经0.1%多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，培养条件为: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培养7 d。
1.4 免疫荧光单标法鉴定NSCs及其子代细胞
1.4.1 Nestin免疫反应阳性细胞
将悬浮培养的细胞团用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在载玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反应阳性细胞
取诱导分化的NSCs的细胞盖玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 NSCs的形态学特征及鉴定
由孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的原代细胞， 接种后立即在相差显微镜下观察，细胞呈悬浮的圆形状，边界清楚，折光性强，绝大部分单个存在。经6～7 d无血清加bFGF培养后，细胞呈球状集落， 95 %以上的NSCs球呈悬浮生长，细胞增殖旺盛（图1）。原代培养时，培养瓶中可见一些细胞碎片和一些贴壁的杂细胞，但经传代后，这些杂质均减少甚至消失，且生长状态良好。在相差显微镜下，NSCs呈球形或椭圆形，大小不一。经Nestin免疫荧光染色鉴定显示神经干细胞球呈红色荧光（图2）。
2.2 NSCs的诱导分化及其鉴定
胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定在NSCs培养液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即开始贴壁和分化，6 h后即可明显发现有突起从团块边缘长出，24 h后有少数细胞分化为有突起的细胞，以后分化的细胞逐渐增多，从细胞球周围迁移出，呈放射状排列（图3）；随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，7 d时在相差显微镜下NSCs球周围可见分化成胞体圆形丰满的神经元样细胞和突起粗大的胶质细胞样细胞。免疫荧光染色显示，在胎牛血清的诱导分化下NSCs能分化成表达各种相应特异性标志的终末细胞，即表达MAP2的神经元（图4）、表达GFAP的星形胶质细胞（图5）；同时，从NSCs分化而来的神经元能表达突触素（图6）。
3 讨论
NSCs是指在哺乳动物中枢神经系统内具有多向分化潜能和自我复制能力的一群细胞，由于具有广阔的应用前景而受到神经科学领域众多研究者的关注，在治疗恶性胶质瘤、神经系统损伤、中枢神经系统慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷顿病）等方面已取得丰硕的成果[6～8]。
NSCs在哺乳动物中枢神经系统内分布非常广泛，本实验从大脑皮层取材，采用机械分离法来制备NSCs悬液，实验效果比较理想。NSCs悬液的制备有酶消化法和机械分离法，但以酶消化法使用居多。由于在实际操作中很难从客观上准确地把握酶作用的最佳时间点，往往导致消化不足而不易获得单细胞悬液；或消化过度造成细胞受损而导致细胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有针对许多神经生长因子的受体[9]，当采用酶消化法来获取NSCs时， 可能会引起细胞表面受损而致使一部分受体丢失，而这些受体对于NSCs 维持其干细胞的未分化状态是必需的。所以采用显微解剖和吸管吹打等机械分离方法来制备NSCs悬液是神经干细胞分离中较为理想的方法。
本实验发现在原代培养时，培养瓶中可见大量的细胞碎片和一些贴壁的细胞，但经传代3～5代后，这些杂质逐渐减少甚至消失。这主要是由于培养液中所含的bFGF只对NSCs具有促进分裂和增殖作用[10，11]，而其他杂细胞在该培养液中无法生长。因此，原代细胞中大部分非NSCs会发生死亡，而NSCs不仅可以存活，还可以分裂和增殖，形成神经干细胞球，从而经过多次传代后， NSCs可以得到纯化。
Nestin是神经干细胞的一个标志物，本实验培养的细胞通过免疫荧光观察培养的细胞球均呈Nestin免疫反应阳性，提示组成细胞球的细胞为NSCs。当在培养液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化为神经元样细胞和胶质细胞样细胞。免疫荧光显示，诱导分化7 d后NSCs可以分化为表达MAP2的神经元和表达GFAP的星形胶质细胞，证明了NSCs具有多向分化潜能。同时，本研究观察到从NSCs诱导分化成的神经元突起上有分化较好的串珠样排列的膨体，突触素免疫荧光染色阳性，显示其已经具备接受信息的结构基础，表明分化的神经元能够合成和运输神经递质，行使可能的生理功能[12]。
实验从孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的细胞团具备NSCs的三大特征：Nestin免疫反应阳性、分裂增殖能力和多向分化潜能，由此证明了所分离培养的细胞是NSCs。并且，由血清诱导分化而来的神经元具备一定的生理功能，可以用于进一步的实验研究。
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【摘要】
目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养的方法，并进行鉴定、标记。方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率；电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物CD29，CD44，CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微结构清晰，可见细胞器，如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体，细胞核呈圆形或不规则，可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核，呈蓝色荧光。结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs，在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。
【关键词】 细胞培养；间充质干细胞；种子细胞；示踪剂
【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.
【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞，可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞，为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上，优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法，以获得稳定的培养体系，为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠(3周鼠龄，60～70 g)，吉林大学动物实验中心提供。
1.2 主要试剂和药品
低糖DMEM培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）储存液(Sigma 公司)。
1.3 分离和培养
Wistar大鼠麻醉后处死，浸泡酒精15 min，无菌条件下分离股骨、胫骨，无血清DMEM冲洗骨髓腔，取混悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬，将获得的细胞接种在100 ml培养瓶中，5% CO2，37℃下培养24～48 h，换液，去除未贴壁细胞，2～3 d更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化，用血球计数仪计数细胞、传代，培养3～5代细胞。
1.4 透射电镜样品制备
将培养3代10 cm2培养皿中约2×106个细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送电镜室，脱水包埋并制作超薄切片，行透射电镜观察并拍照。
1.5 MSCs表面标记物检测
0.25%胰酶消化收获第3代细胞，收集1×106个细胞，洗涤1次，0～4℃预冷的70%乙醇1 ml边加入边摇匀，混匀后置于4℃冰箱待进行细胞表面标记物检测。检测时以1 ml PBS洗涤2次，加含10%山羊血清的 PBS常温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min去上清，与饱和浓度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下闭光反应30 min，PBS 洗涤细胞，置于冰上，行流式细胞仪检测。
1.6 MSCs标记
将无菌的DAPI 储存液加入培养的MSCs爬片上清中，至终浓度为50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。荧光显微镜下观察细胞爬片。
2 结 果
2.1 MSCs相差显微镜观察细胞形态
骨髓细胞接种于培养瓶后，约6～8 h可见MSCs细胞贴壁，呈圆形或多角形，换液后，贴壁细胞清晰可见，2～3 d后可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；6 d左右可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起、胞核大、核仁清晰。约14 d细胞融合80%～90%，呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长，3～4 d可见长梭形细胞80%～90%铺满培养皿形成单层。见图1。
2.3 MSCs的鉴定及标记
第3代细胞表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。见图3。细胞经DAPI标记后，细胞核呈蓝色。见图4。
3 讨 论
由于骨髓的细胞组成复杂，细胞功能各异，其中MSCs含量很低，约为骨髓低密度组分中有核细胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分离高纯度的MSCs是原代培养关键性技术。目前，获得MSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分选法〔4〕。而骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，且分离的MSCs贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的MSCs分离方法。
一般认为，间充质干细胞没有特异性表面抗原，整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要标志物〔5〕，而MSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。因此，实验选取MSCs表达阳性的指标CD29、CD44，以及表达阴性的指标CD34和CD45作为鉴定参考指标〔2，6〕。本研究选择了CD29、CD34、CD44和CD45进行检测，结果表明培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合MSCs的特点，经过传代，第三代可获得较高纯度的MSCs，可以作为稳定的种子细胞进行体内研究。
DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。移植细胞的标记是研究其在体内的定位不可缺少的，目前常用的标记法有DAPI标记法、溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法、染色体标记法、基因标记法。BrdU法存在只能标记增殖期细胞，且标记细胞不能直接观察等不足。染色体标记主要将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内，通过Y染色体杂交区别确认移植细胞。其优点在于可以终生标记，但也存在操作繁琐，无法观察活细胞等不足。基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材，使被标记细胞携带绿色荧光蛋白（GFP）暼报告基因。但目前，实现报告基因在目的细胞中高效稳定表达仍然存在程序繁琐、实验周期长、成功率低等困难，而从转基因动物取材又因为动物来源困难，在国内较少开展〔7〕。本研究表明，DAPI起初标记率很高(接近100%)，1 w内可维持80%～90%标记率。但随着标记时间的延长，其标记效率迅速下降，3 w以后绝大多数细胞失去标记。
本实验完善贴壁法建立Wistar大鼠MSCs培养体系，经鉴定细胞纯度高，可以为体内移植提供大量的种子细胞。采用DAPI 进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有MSCs 均已被标记蓝色荧光，提示DAPI 标记法敏感性好，标记效率高，可应用进行体内细胞移植的良好标记。
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