时间：2023-03-22 17:42:10
序论：在您撰写细胞生物学论文时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
关键词:医学细胞生物学;教学模式;教学改革
医学细胞生物学是一门以细胞生物学和分子生物学为基础，探索研究人体细胞发生、发育、增殖、衰老、死亡以及细胞结构与功能的异常与人类疾病关系的学科［1］。医学细胞生物学是临床医学、检验医学、口腔医学、预防医学等医学专业的一重要基础课，同时也是生理学、病理学、免疫学、组织胚胎学、药理学等医学基础课程以及后续临床课程的基础［2］。学习医学细胞生物学的基本理论知识有助于医学专业学生从分子细胞层面理解人体生命活动规律和疾病发生发展进程，为专业课学习和后续的科研工作奠定坚实的理论基础［3］。医学细胞生物学是一门实验操作性极强的学科，实验教学是这门课程教学工作中的重要实践环节，在培养学生动手能力、实践探索能力和科学创新能力等方面具有重要作用［4-6］。传统的教学理念和教学方法已经不能满足新时代的需要，如何能在有限的时间内，让学生系统掌握医学细胞生物学的基础理论知识，并熟练掌握基本实验操作技术，是新形势下医学细胞生物学教学改革的一项重要内容［7-8］。本文结合郑州大学基础医学院的实际情况，对医学细胞生物学理论课及实验课教学中存在的问题及改革策略进行探讨并提出建议，以提高医学细胞生物学教学质量。
1提高医学细胞生物学理论课教学质量的建议
1．1理论课教学内容的改革
首先，针对不同专业，因材施教。临床医学、检验医学、法医学、临床药学、预防医学等专业均需要开设医学细胞生物学。任课教师应该结合教学大纲并根据教材内容，为不同专业的学生制定相应的教学计划和授课内容，按照学校的课程设置，多方面、多角度、多层次因材施教，提高医学细胞生物学的课堂教学效果。其次，注重基础理论，由浅入深。注重教学内容的基础性，构建并完善由细胞基本结构及其功能、细胞重大生命活动现象及本质等所组成的理论教学体系，加强学生对基本理论知识及基础实验技术的理解。授课教师应该以真核细胞的结构与功能为教学重点，使学生对细胞的主要结构及其功能等有系统、全面的了解和认识。然后，精炼教材内容，突出重点。医学细胞生物学课程的内容较多，但课时有限，所以，任课教师应精炼教材内容，有的放矢授课。该门课程的必修内容是认识人类自身生命活动的基础，也是认识疾病发生、发展的理论基础。授课教师在授课过程中要注意精练授课内容，突出重点章节，同时，课后需要对本节课的内容进行归纳总结。
1．2理论课教学方法的改革
首先，使用启发式教学。授课教师应该在课堂上开展启发式教学，实现教师与学生的课堂互动。启发式教学相比传统单纯由教师讲课的教学方式更具有优势，可以更加有效地激发学生的学习兴趣。启发式教学不但注重知识的传授，更注重能力培养，因此，启发式教学可提高学生的思维能力和创新能力。其次，使用多媒体教学。医学细胞生物学课程中有很多细胞结构图和分子机制图需要制作成动画，以使复杂抽象的内容变得直观有趣，调动学生的学习主动性，增强学生的学习兴趣。同时，任课教师可以充分利用网络资源，搜集医学细胞生物学的视频课件资料并运用到课堂教学中。这样既可以拓展学生的学术视野，又可以提高学生的综合素质。然后，使用案例式教学。案例教学是在事实案例基础上的一种开放式、互动式的新型教学方式。医学专业学生不仅要掌握细胞的结构、功能，还应该熟悉细胞的病理改变与疾病发生发展的关系。但是由于医学细胞生物学课程的理论性强、内容抽象，所以任课教师应该积极探索案例式教学，以激发学生的学习兴趣，提高医学细胞生物学的教学质量。
1．3理论课考试方式的改革建议
首先，优化考试内容。任课教师可以通过以下几点优化理论课程的考试内容:(1)建立和完善理论课程的考试题库，保证理论课程考试的有效性;(2)根据本院开设的临床医学、检验医学、预防医学等专业设置相对应的考试题目;(3)指导学生撰写综述性论文或科研标书，以培养医学专业学生良好的思维能力和创新意识。其次，优化考试形式。任课教师可以通过以下方法优化理论课程的考试方式:(1)构建综合丰富的考试方式。建立平时成绩和期末考试成绩相结合的考试体系;(2)增加创新能力考试的比重。任课教师让学生按照要求写出科研标书并进行打分;(3)增加平时表现考试的比重。平时表现考试主要是在课堂上对学生回答问题的情况予以评分并记录。然后，优化评价方案。任课教师可以通过调整期末闭卷考试及平时表现考试优化评价方案。理论课考试中的期末闭卷考试成绩占理论课总成绩的70%，试题从考试题库中随机抽取。同时理论课考试中也包含学生的平时成绩，这一部分占总成绩的30%，包括学生的出勤情况、课堂上回答问题的情况以及学生完成综述性论文的情况。
2提高医学细胞生物学实验课教学质量的建议
2．1实验课教学内容的改革建议
首先，优化实验教学大纲。由于受到课堂学时及硬件条件等方面的制约，很多院校的医学细胞生物学课程的实验课内容仅仅局限在一些验证性和基础性的实验。任课教师需要调整教学内容，增开一些与理论课程密切相关并且与学科前沿紧密联系的综合设计实验。这样可以激发学生的学习兴趣，更好地发挥学生的积极性和主观能动性。其次，培养学生创新能力。任课教师可以在基础性实验之外开设一些探索性及创新性较强的综合实验，例如细胞融合实验、细胞凋亡实验、细胞免疫组织化学实验和免疫荧光实验等。培养并提高学生的实际操作能力以及分析问题和解决问题的能力，使学生初步具备进行设计性实验的能力，提高学生的科研素质和创新能力。然后，设置开创综合实验。任课教师应当结合理论课内容及相关临床应用，修改完善实验课教学大纲，科学设置实验内容，培养学生的实验操作能力，以增强学生的科研兴趣为重点，在实验课教学中适当增加一些开放性强且创新性强的综合实验，让学生运用已掌握的知识与技术进行更深入的研究设想，培养独立科研工作的能力。
2．2实验课教学方法的改革建议
首先，应用启发式教学。与传统的实验课教学相比，在启发式的实验课教学中，任课教师应该在讲解实验目的和原理后，鼓励学生根据所学的知识设计实验过程，然后分析研究最后得到的实验结果以探索实验原理。采用启发式教学可以培养学生的思维能力，引导学生积极思考，启发学生从不同的角度考虑问题，期提高学生的综合科研素质。其次，使用多媒体教学。在医学细胞生物学的实验课教学中，多媒体技术的应用能够极大地方便课堂教学工作。多媒体教学形象生动、易于理解，可以方便地解决一些不容易讲解或者难以开展的实验。另外对于某些受条件所限而不便亲自操作的实验，学生可以观看教学演示片，全面了解这些前沿实验仪器的结构、性能和用途。然后，开展研究型教学。医学细胞生物学的实验课程与科研工作相结合可以提高学生的学习兴趣和科研热情。任课教师在实验课堂上采用开放式的研究型教学可以激发学生的求知欲，让学生学会分析问题和解决问题。开放式研究型的实验课教学，让学生经历严格的科研训练，为以后申报、参与以及实施各种创新性科研项目奠定基础。
2．3实验课考试方式的改革建议
首先，优化考试内容。为全面、科学地考察学生的实际动手能力以及科研创新能力，改革后的医学细胞生物学实验课的考试内容应该以核学生的实验操作水平为主，以考试学生的理论知识水平为辅。这种改革模式，可以培养学生在实验操作过程中分析问题、解决问题的能力，并拓宽学生对实验操作技术在临床应用中的思考。其次，优化考试形式。建立完善的成绩评定体系是保证实验教学质量的关键。实验课程的考试应是一个全方位、多角度、全时段的综合评测，包括平时课堂考试及综合实验考试，平时课堂考试包括出勤情况、课堂回答问题情况和实验操作情况、实验报告完成情况，综合实验考试包括实验理论考试、实验操作考试、开放性及探索性实验考试等。然后，优化评价方案。实验课的考察应该以考察学生运用实验技术的能力为主，包括以下几点:(1)考察学生的平时成绩，包括出勤情况、实验报告完成情况等，占实验课总成绩的20%;(2)考查学生的理论水平，包括实验基本原理、实验技术手段、实验操作方法等，占实验课总成绩的20%;(3)考察学生的实验操作，占实验课总成绩的60%。综上所述，医学细胞生物学的教学是教师与学生共同学习、教学相长的过程。在这个过程中，首先任课教师需要不断提高自身素质，认真做好科研工作并积极学习本课程最先进的理论知识与最前沿的实验技术。其次，任课教师也需要精心把握课程内容，不断总结教学经验，比较各种教学方法的优劣，并将各种教学方法有机结合、交叉运用。同时，任课教师可以根据学生的不同专业方向，改进传统教学模式中教案和课件的内容，在上课时适量引入案例教学，从而调动学生的学习兴趣，提高学生的综合素质。另外，任课教师也需要加强实验课教学的比重，改革实验教学内容，完善实验教学条件，采用多种教学手段，建立完善评价体系，并不断探索研究新实验，使实验课堂更富有学术气氛。以上这些举措是提高医学细胞生物学的教学质量，培养适应现代社会发展的具有较强的综合能力和科研素质，具有独立发现问题、思考问题、分析问题及解决问题能力的创新型医学专业人才。
作者:郑皓 单位:郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系
参考文献:
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［5］唐历波，李栎，肖憬．临床专业医学细胞生物学实验课程改革的几点建议［J］．治学之法，2014(6):178-179．
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RT-PCR检测耐药相关基因MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA的表达取对数生长期细胞，TRIzol试剂提取细胞总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，SYBYGreen方法进行实时荧光定量PCR实验。引物设计由Invitrogen公司合成，见表1。PCR反应体系：cDNA1μl，2×SYBRGreenPCRMastermix12μl，引物F/R（上下游引物的终浓度各为15pmol/μl）各0.3μl，DEPC水11.4μl，共25μl。PCR循环设置：50℃2min95℃10min（95℃15s60℃1min）×40个循环（生成扩增曲线）95℃15s60℃15s95℃15s（生成溶解曲线）。SDS2.2软件分析处理数据，管家基因校正目的基因的表达，得到相对定量结果。1.6耐药细胞的保存耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存于含0、10、30nmol/L紫杉醇药物的冻存液里。于冻存后1、3、6月分别复苏细胞，观察复苏情况，MTT法检测IC50。1.7统计学方法对有关数据采用SPSS13.0软件进行独立样本t检验（independentsamplet-test）、单因素方差分析（OnewayANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1耐药细胞的建立
SKOV3经300μg/ml大剂量的紫杉醇作用2h后,大部分细胞死亡漂浮，剩余细胞肿胀，伸出树枝状突起呈蜘蛛状，胞质见空泡形成、颗粒增多。少量存活的细胞克隆生长，恢复生长至对数期消化传代，再进行下一次冲击；SKOV3经10~30nmol/L小剂量的紫杉醇作用24h，约50%的细胞死亡，细胞体积增大，形态不规则，胞质内颗粒增多，贴壁性变弱，给药24~72h内最明显，96~120h后逐渐恢复原状。经两种诱导方法获得的耐药细胞系，分别命名为SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30。
2.2耐药细胞的生物特性
2.2.1耐药指数MTT实验结果显示，耐药细胞及其敏感细胞的IC50值及耐药指数，可见小剂量浓度递增诱导的耐药细胞SKOV3/TAX30耐药性较强，见表2。2.2.2平板克隆形成实验在无药物作用时，SKOV3敏感细胞较两种耐药细胞系的克隆形成能力强，见图1A的d组，SKOV3敏感细胞的克隆形成数为（934±16.37），SKOV3/TAX300的克隆形成数为（440±13.75）,SKOV3/TAX30的克隆形成数为（579±9.50）。与敏感细胞SKOV3相比，两种耐药细胞克隆形成数少，差异有统计学意义（P均=0.000），见图1B。而在相同浓度紫杉醇作用下，耐药细胞形成的克隆明显多于敏感细胞。在紫杉醇浓度为5nM时，SKOV3/TAX30可形成（1206±9.50）个克隆，SKOV3/TAX300可形成（870±32.30）个克隆，而SKOV3形成的克隆数仅（202±6.08），差异有统计学意义（P均=0.000）；当紫杉醇浓度进一步升高为50nM和500nM时，SKOV3/TAX30和SKOV3/TAX300形成的克隆数仍明显高于敏感细胞SKOV3。紫杉醇浓度为50nM时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.013）,SKOV3细胞与SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异也有统计学意义（P=0.000）；紫杉醇浓度为500nmol/L时，SKOV3细胞与SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞形成的克隆数相比，差异有统计学意义（P=0.009、0.0001），见图1B。2.2.3生长曲线倍增时间的差异SKOV3敏感细胞和两种耐药细胞系在相同条件下培养7天，细胞增殖产生一定的差异。耐药细胞的生长较敏感细胞减慢，生长曲线的斜率减小，见图2。同时，根据生长曲线计算出SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞的倍增时间分别为28.90h、24.0h，与敏感细胞的倍增时间20.84h相比也有所延长。
2.3耐药相关基因
MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCA在各细胞中的表达MDR1、BCL2L1、LRP、PRKCAmRNA在SKOV3、SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30细胞中的相对表达丰度见图3A、3B。两种耐药细胞中，MDR1的表达明显增高，提示SKOV3/TAX300、SKOV3/TAX30对紫杉醇的耐药与MDR1高表达有关。SKOV3/TAX300细胞中PRKCA、LRP的表达均高于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P=0.016，P=0.005），BCL2L1的表达与敏感细胞比较，差异无统计学意义（P=0.815）。而SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义（P=0.154，P=0.206）。BCL2L1的表达低于敏感细胞（P=0.001），见图3B。以上数据表明不同诱导方式导致耐药细胞发生不同生物学变化，可能存在不同的耐药机制。
2.4耐药细胞的保存
耐药细胞SKOV3/TAX30分别冻存在含有0、10、30nM紫杉醇的冻存液中，于冻存后1、3、6月复苏，检测IC50，见表3。1、3月后检测结果提示，在3种药物浓度条件下的细胞IC50没有明显区别，但冻存6月后，无药冻存组的耐药细胞与两种加药冻存组的细胞比较，其IC50明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）。同一个药物浓度条件下，无药冻存组的耐药细胞在冻存6月时，出现耐药性下降，而两种加药冻存组细胞在6月的冻存过程中，细胞IC50虽然出现轻度下降，但差异无统计学意义。
3、讨论
3.1耐药细胞的建立
本实验结果提示：增加给药剂量、适当延长无药间歇期，可能延缓细胞的耐药性。由于大剂量冲击诱导与临床治疗模式相似，临床上体内耐药指数≥2倍即足以导致化疗失败[5]，因此大剂量冲击诱导产生的耐药细胞虽然耐药指数较低，也是模拟临床耐药的良好模型。
3.2耐药细胞的特性
本研究的结果表明：在无药物作用时，SKOV3细胞的集落形成能力强于两种耐药细胞SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30，但在不同浓度紫杉醇药物条件下，耐药性最强的SKOV3/TAX30集落形成能力也最强，而敏感细胞SKOV3的集落形成能力最弱，此结果与MTT法检测的耐药性一致。紫杉醇的作用机制是促进微管蛋白二聚体装配成微管，抑制纺锤体形成，将细胞阻断于G2/M期，细胞的有丝分裂异常或停止，使多核细胞的形成增多[6]。诱导的过程中耐药细胞膨胀、形态不规则、细胞体积的增大可能与细胞群体中多核细胞的增多有关。本研究的生长曲线实验中，SKOV3/TAX300和SKOV3/TAX30的倍增时间分别为28.9、24.0h，与敏感细胞SKOV3的倍增时间20.84h相比有明显延长，显示耐紫杉醇的卵巢癌细胞生长速度减慢。细胞周期的阻滞，除导致一些细胞周期特异性药物失效外，肿瘤细胞处于相对静止状态，易对化疗药物产生耐受。
3.3耐药相关基因的检测
卵巢癌紫杉醇耐药机制的研究中，多药耐药（multidrugresistance，MDR）一直是热点。多药耐药是指对一种药物具有耐药性的同时，也对其他结构和作用机制完全不同的化疗药物产生交叉耐受的一种现象。多药耐药的产生是一个多因素的过程，主要包括：（1）细胞内有效药物浓度的降低；（2）细胞内药物活性的改变；（3）凋亡的抑制；（4）肿瘤细胞微环境改变化疗敏感度。P-gp是多药耐药基因MDR1编码的相对分子质量为17kD的一种跨膜糖蛋白，其功能是使细胞内药物浓度降低，药物的作用减弱或丧失，细胞由此获得耐药性。与大多数其他化疗药物的多药耐药机制相似，紫杉醇作为P-gp的作用底物之一，其耐药机制与MDR1基因扩增导致的P-gP高表达密切相关[7-8]。肺耐药相关蛋白LRP是在多药耐药的肺癌细胞株中发现的与MDR相关的非糖蛋白，相对分子质量为110kD，能阻止药物通过核孔进入细胞核，避免其作用于核内靶点，药物运送到胞质的囊泡中，再通过胞吐作用将药物排出体外，从而发生紫杉类药物耐药[9-10]。凋亡抑制基因也参于紫杉醇耐药。BCL2L1基因，全称为BCL-2样1基因（BCL-2-like1）,编码蛋白属于BCL-2蛋白家族，BCL-2蛋白家族通过抑制肿瘤细胞凋亡，导致耐药性[11-12]。PRKCA基因为蛋白激酶Cα（proteinkinaseCalpha），也被称为PKCA、PRKACA、KPCA、AAG6。细胞过度增殖和抗细胞凋亡机制障碍都可导致肿瘤进展和耐药现象发生[13]。另外PKC的作用是使底物蛋白磷酸化而活化，p-gp是PKC的作用底物，当其表达增加或活性增强时，可使大量的P-gp磷酸化而活化，从而产生耐药性。本研究结果提示。SKOV3/TAX300细胞PRKCA、LRP的表达均略高于敏感细胞。但SKOV3/TAX30细胞的PRKCA、LRP的表达与敏感细胞比较差异无统计学意义。BCL2L1在SKOV3/TAX30细胞的表达低于敏感细胞，但SKOV3/TAX300细胞中BCL2L1的表达略高于敏感细胞，结果提示不同方式诱导的耐药细胞，可能存在不同的耐药机制。
3.4耐药细胞的保存
1．1组织块贴壁法分离培养hUC-MSCs脐带取自正常分娩的新生儿(征得其父母同意)。首先用含双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗脐带3次，去除杂物;用无菌的手术剪刀将脐带剪成3～4cm的节段，再沿长度方向剪开，以暴露脐带胶质部分，去除血管;置于含双抗的PBS中清洗3次，去除血污，再剪成约0．5cm3的组织块，以胶质部分贴于基底平铺于24孔板中，每孔2～3块，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育1～2h;待组织块自然粘附于皿底部后加入含双抗、FBS的低糖DMEM培养基，继续置于培养箱内培养，每3d更换一次培养基，待观察到有小三角形或梭形细胞从组织中铺展出时，取出组织块。整个分离过程注意无菌操作。待细胞生长至70%～80%汇合时，即可传代。利用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第5代细胞，采用细胞免疫荧光技术鉴定hUC-MSCs的表面标记物CD44。
1．2肝细胞标志基因的检测按照总RNA提取试剂盒的操作说明分别提取hUC-MSCs和人肝癌细胞HepG2的总RNA，用RNase-FreeDNaseⅠ去除基因组，最后检测RNA的浓度和纯度，立即进行反转录合成cDNA或保存于－80℃备用。采用Prime-ScriptTMⅡHighFidelityRT-PCR试剂盒反转录2μgRNA得cDNA，取2μL用于PCR。根据GenBank提供的人肝细胞标志基因序列，使用PrimerPremier5．0软件设计引物，引物序列和产物大小见表1。GAPDH为内参对照。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环;最后72℃延伸5min。PCR产物用20g/L的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶分析系统下拍照。
1．3PAS糖原染色按照PAS染色试剂盒的说明书操作，对第5代hUC-MSCs和HepG2进行糖原染色，在倒置相差显微镜下观察并照相。
2结果
2．1hUC-MSCs的分离、培养、传代及鉴定组织块贴壁培养3～4d时，可观察到组织块间隙铺展出小三角形或长梭形的细胞，继续培养至7d左右，可观察到局部细胞呈集落生长，此时，在无菌条件下取出组织块，更换新鲜培养基，继续培养1周左右，细胞可达80%～90%汇合，即可传代。用胰酶/EDTA消化后细胞呈亮而圆的单个分散状，以1∶3的比例进行传代，约4h贴壁，2d后迅速生长。倒置相差显微镜下可观察到细胞较大，轮廓清楚，内部有清晰的应力纤维，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显，呈典型的成纤维细胞样形态(图1A);持续培养大约2周时，细胞基本达到完全汇合，形态发生一定的变化，胞质变得狭窄，内部的应力纤维也不明显，呈平行排列或漩涡生长(图1B)。连续多次传代，细胞保持稳定的、相对均一的成纤维细胞样形态以及较强的增殖能力。经鉴定分离培养的细胞CD44呈阳性表达，且具有良好的均质性。
2．2肝细胞标志基因的表达以HepG2作为阳性对照，用RT-PCR检测hUC-MSCs的肝细胞标志基因的表达情况，结果见图2，hUC-MSCs表达ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，不表达TAT。
2．3PAS糖原染色结果对hUC-MSCs和HepG2进行PAS糖原染色，染色结果显示两种细胞的细胞质中均有紫色颗粒物形成，即均呈糖原阳性反应(图3)。
3讨论
MSCs能分泌多种细胞因子和生长因子，具有直接或间接的抗炎及抗纤维化作用，可抑制肝细胞的死亡和纤维化;还可通过其分泌物抑制肝细胞的凋亡、刺激肝细胞再生、为受损肝细胞提供营养支持等。MSCs还具有低免疫原性及免疫抑制力，适用于进行同种异体移植，在移植后可迁移、归巢至受损的组织，发挥治疗作用。因此，MSCs在肝脏疾病的细胞移植治疗中具有广阔的应用前景。研究发现，相较不同来源的MSCs，脐带来源的MSCs不仅具有干细胞的特性，而且来源丰富、取材方便、增殖能力较强、无伦理法律限制，还具有较低的免疫原性和分化程度，从而成为一个非常有吸引力的移植治疗肝病的细胞来源。
作者采用组织块贴壁培养法从脐带基质中分离获得hUC-MSCs，与酶消化法和流式细胞仪或免疫磁珠分选法相比，该分离方法操作简单，消耗低，易于控制。分离培养的hUC-MSCs呈典型的成纤维细胞样形态，具有MSCs的表型特征，均质性良好，且在体外长期培养中能保持稳定状态。进一步的RT-PCR结果显示，培养的hUC-MSCs同时表达成熟肝细胞的标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET，而不表达TAT，与Campard等的研究结果一致，提示hUC-MSCs可能具有肝细胞的一些相关功能，如合成白蛋白、合成糖原及解毒功能等;PAS糖原染色结果则证明hUC-MSCs具有糖原合成和储存能力。
经济的迅猛发展带动科技的日新月异，网络技术与通信技术发展迅速，微信、微博等交流媒介成为大众知识共享的传播平台，而微课作为教学中的创新也备受关注，作为对传统教学模式的颠覆，其更注重教学效率的提升与教学质量的理想化。伴随移动学习时代的到来，微课使得当前学校教育及社会教育都发生了显著的变化。但是我们应该看到，时代催生的网络视频也带有某种弊端性，难以真实有效地满足各个层面的学习需求[1]。焦建利教授提出：传统的课堂实录视频资源已经难以实现互联网时代人们注意力模式的匹配，因此传统的教学方式也很难满足师生教与学的需求。
加上网速及宽带的硬性限制，教学资源周转率低，优秀教育教学资源被无形浪费。基于这样的背景，微课诞生，吸取了传统教学视频的弊端教训，更注重主题的突出明确，更具有针对性与服务性，在内容设置上也趋于短小精悍，实现了自由补充与延伸[2]。对于生物细胞学科教学来说，实验是教学的关键，在教学中发挥着重要的作用。不可否认的是生物学作为生命科学的前沿学科之一，无论是实验技术方法还是理论知识阐述都实现了深度的提升与广度的延伸，逐渐实现与遗传学、分子生物学及发育生物学的学科融合，逐渐在生命科学研究领域占据主导[3]。因此，实现微课与细胞生物学实验教学的结合，对学生创新能力与独立思考能力的培养逐渐成为生物实验教学关注的焦点，成为细胞生物学实验教学改革的要务。
一、微课简述
1.微课的起源。微课最早由美国爱荷华大学LeRoy A. McGrew教授提出，初衷是针对化学课程总结的60秒概述，设置了三大主体部分，分别为总体介绍、解释说明及举例分析。后来英国学者T.P.Kee在此基础上提出了一分钟演讲，所谓的一分钟演讲就是突出演讲的精练传神，要求具有缜密的逻辑结构及真实生动的案例阐述。在经过上述两个阶段的发展后，微课由美国新墨西哥州圣湖安学院大卫.m.彭罗斯提出并创建实施。其包括15到30秒的介绍及结论，服务与上文的关键概念导引。然后录制上述内容并限制时间为3分钟内，在微课程指引下提出书面作业要求，学会借助课外阅读或者实践活动完成关键知识的学习。目前最具代表性的当属Educause的微课理念，不是指微观学习中的微内容，而是以建构主义学习理论为支撑的在线教学或格式化教学中的教学实际。
2.我国微课发展现状。我国微课依然是新兴事物，起步晚，发展相对缓慢，目前涉及领域也有部分处于空白。基于微课的发展现状，当前学术界也未就微课理念达成共识。学者焦建利[4]认为，微课是对某一知识点的集中阐释，主要特点就是短小精悍，在线教学视频是其主要表现形式。学者祝智庭[5]则认为微课应该就某个教学主题展开延伸，组织精细化的课堂教学设计，时间限度最好控制在10分钟以内。而学者胡铁生[6]则认为微课程注重的是视频的微小，因此在针对单一学科或者单一知识点组织教学时应注重教学情景的融入，突出在线学习与自由学习。这一概念也逐渐被大众所认可。资源建设方面，我国微课也尚未成型，目前的应用研究还相对零散，评价模式也有待完善。实现微课程的规范化发展还有很长的路要走。
二、细胞生物学实验教学存在的问题
1.内容更新缓慢，亟待加强。我国的细胞生物学实验教学一直处于教学滞后阶段，仅仅作为理论教学的补充或者教学附属而开设，缺乏关注上必然影响教学的创新与跟进，加上该实验教学项目单一化趋势严重，时代气息不足，技术手段及知识的综合运用十分缺乏，内容更新十分滞后。
2.教学方式单一化，学生自主性不足。细胞生物学实验的基本流程就是提前由教师准备好实验材料、实验仪器及实验试剂，学生在教师的示范引导下按部就班地进行实验操作，整个操作过程趋于程式化、简单化。学生不仅无法在实验准备阶段有所参与，更挫伤了学生创新与研究的积极性。
3.教学方法贫乏，缺乏对学生创新能力培养的关注。传统的细胞生物学实验教学受有限的教学时间的限制，因此实验内容与要求也大多提前限定，教师单纯地演示讲解，学生被动地参与学习，双方互动交流不足，教师也无法引导学生进行实验的创新。
4.教学技术陈旧，现代教育技术参与较少。细胞生物学作为生物教学的前沿学科，理应注重教学的创新，特别是积极加入现代教育技术的创新元素，以信息技术为核心推动实验教学。但是我国细胞生物学的教学现状却是现代教育技术十分欠缺，传统实验教学维度单一化趋势严重。
三、微课在细胞生物学实验中如何应用
1.微课的特性和优势，传统多媒体教学的弊端：伴随多媒体技术的迅猛发展及教学融入，部分教师开始尝试运用多媒体辅助教学，但是当代大学生自由散漫的个性也成为多媒体辅助教学实施的制约因素，学生难以集中精力听取教师讲课，精品的视频资源难以得到高效率的运用。应用于课后学习的视频资料也难以受到学生的关注与重视，多数处于闲置。微课则突破了视频教学的局限，具有普通视频教学资源不具备的教学优势。首先，其教学内容浓缩，教学时间较短，借助移动端操作更为便捷，学生学习积极性显著提升。其次，其教学主题十分明确，学生能够迅速找到自己感兴趣的点，从而获得启发教育或者延伸学习。最后，微课视频的教学容量相对较小，符合学生的接受能力，学生更积极主动地参与到微课学习中去。
2.细胞生物学微课设计，把握10分钟原则：注意力10分钟。10分钟内有明确的教学目标，内容短小，集中说明一个问题的小课程。微课设计ADDIE模型：A，分析;D，设计;D制作;I应用;E，评价。通常来说，微课设计要想保证自身的完整性必须具备6个基本环节，分别为教学主题的明确、前段分析、微课基础知识点的切割与划分、微课资源要素的重点设计、微课视频录制及后期加工处理、微课的最终终端输出与展现。6个环节紧紧相扣，推动微课的高效开展。
四、微课引入实验教学的意义与应用前景
微课具有广阔的教育应用前景。2011年，手机将取代个人电脑成为个人信息中心。学生自带设备BYOD，包括个人电脑、手机、上网本、平板等越来越普遍化。这为微课的实施提供了必备的硬件前提。调查中发现，84.44%的被调查者认可微视频在微课教学中的核心地位与作用，并且70%以上的人认为配套的教学设计与课件也是不可忽视的部分。纵观当前的教育改革，多数一线教师已经充分认识到微课教学的魅力与优势，开始在课堂教学中尝试微课教学。其中范福兰等人在基于交互式微视频教学资源教学应用效果的调查显示，70.5%的学生认为交互式微视频资源能够激发他们对课程学习的兴趣，单一的图文及音视频资源则受关注度一般，这也从侧面说明随着流媒体技术的发展成熟，微视频的教学前景将是广阔而光明的。
五、一些值得思考的问题
1.有关微课适用性，微课程在全国范围内展开，带来教学思想、教学模式的重大转变，各个领域、各种培训、不同学科对于微课程应用的尝试存在“泛用”、“滥用”现象。微课程适用于哪些领域、哪些课程、哪些内容以及荧光怎样设计、怎样制作、怎样使用才是最科学合理的成为今后科学研究的新课题。
2.细胞生物学实验微课应用存在问题，我国针对该专业的微课理论研究及实践演练依然不足，多数高校在微课开展实施的过程中存在建多用少的资源浪费现象。因此必须将微课作为校本研修资源，对其加强引导宣传，让教师认可微视频教学的优势并拓展专业发展的新途径。此外微课程应奠定创新型教学模式的资源基础，以期为学生提供更实用的教学资源，做好教学辅助。当然微课作为新兴教学理念，应该在移动学习与泛在学习的基础上实现教学需求与教学实践的同步发展，最大限度提升微课程的开展利用率。
六、总结
微课作为新兴的教学模式理应受到关注，了解微课的本质内涵，在梳理其优势与缺陷基础上综合当前的运用实际，科学预测并规划后期发展，实现微课在设计开发与应用上的创新完善。本文就微课教学的几点问题进行了归纳分析，以期为微课教学的拓展应用提供有效思路，让微课的魅力更多地展现出来，服务于高校教学。
1.课程设置合理化
研究生课程体系的设置做到适时调整，丰富选课资源的同时，加强学生选课的自主性，充分考虑学生的个性化培养的需求。
2.优化教学内容
创新型人才培养模式改革首要是课程改革，而课程改革首先要解决的问题是教学内容的优化。研究生创新能力的培养应该是建立在知识、能力、素质的辩证统一的基础上。知识作为能力和素质的载体，是不可或缺的重要一环，研究生阶段知识的获取不应该局限于本科阶段的某一本教材的重复拓展。我们在课堂设计中集思广益，打破教材的局限，以学生兴趣为出发点，设置了十个小的专题题目，专题内容涉及细胞生物学的基本技术及其创新、前沿知识、热点领域，并充分考虑细胞生物学与医学的密切关系。如细胞通讯、细胞信号跨膜转导及其与疾病的关系，端粒、端粒酶和肿瘤的关系及其研究进展，细胞骨架与运动和神经系统疾病的关系举例（原因分析、分子细胞学调整、研究进展）等。学生既能从中巩固提炼的基本理论框架，又能获得丰富的前沿信息，在学习中还有助于科研方向的确立和科研思维的培养。
3.改革教学方法
我们在前几年的教学中留心对研究生的理论基础、能力水平和喜欢的教学模式做了问卷调查，相对于本科生研究生阶段学生的特点突出表现为：已经具有比较广泛、系统的理论知识基础，并具备一定的分析问题的能力，更向往自由的思维和互动表达。综合研究生的特点和现代教育技术的发展，我们在课堂教学中试行教学方法改革，彻底改变教师灌输知识的单一模式，更多地让学生自主学习，教师担负引导、组织实施、总结和考评的职责，更多的时候也是讨论和争论的主体之一，变师徒关系为伙伴关系。具体实施是依据学生兴趣分组，3~4人/组，组内分工协作，依据自己所选的感兴趣的专题查阅资料，开展讨论并推举一人以PPT文稿的形式图文结合在课堂上汇报讲解，同学可以自由提问，教师做针对性的点评、补充。创新的课堂组织从学生的兴趣出发保障了自主学习的效率，协作中锻炼了学生的团队意识和合作能力，课堂表达和提问互动有效地活跃了学习气氛，调动了学习的积极性，并提高了学生综述及表达能力。此种形式受到了选课学生的一致好评，也吸引了更多的研究生加入我们的学习队伍中。
4.考评手段合理化
在转变教师单向传授知识模式的同时，打破以考试分数作为衡量教育成果的唯一标准的划一呆板的考评制度。对学生学习的评价主要是课堂表现和实践实训，各占50%。课堂表现的评价中以小组汇报讲解中的综合能力表现作为主要的考评指标，并逐步完善了评分标准，简介如下：基本原理简明扼要、切中要点、通俗易懂；研究应用举例典型、兼顾多方面；重视结果分析（尽量使用图表）；重视技术发展的进展和研究理论进展（突出新意）。除了陈述者有奖励分之外，课堂提问及回答者都有酌情加分，极大地调动了学生的积极性。学生课前准备、课堂提问、课后总结的学习资料都可以组织建立个人学习档案，学习档案也可作为酌情加分的因素。
二、反馈与思考
教学内容、教学方法及新的考评方法改革的突出优势在于爱护和培养学生的好奇心、求知欲，帮助学生自主学习，独立思考，保护学生的探索精神、创新思维，营造崇尚真知、追求真理的氛围，为学生的禀赋和潜能的充分开发创造一种宽松的环境。让学生感受、理解知识产生和发展的过程，培养学生的科学精神和创新思维，重视培养学生收集处理信息的能力，获取新知识的能力，分析问题和解决问题的能力，语言文字表达以及团结协作能力。但在试行新的教学方法的同时，我们也发现了一些有待于改进的问题。在课程体系的设置中需要合理调研，依据社会、培养目标和学生主体的需求做出调整，充分适应多学科交叉融合的需求。在教学内容的优化上，学生更注重研究进展的讨论和热点文献的分析，教学内容需要每年更新，不能一成不变。在教学方法改革中，试行讨论式课堂的问题反应在四个方面：个别小组成员因自制力不强、计算机水平限制、口头表达能力欠缺等原因对所选专题的基本理论或研究进展陈述不清楚，会一定程度上影响其他同学对该专题领域的学习。在课堂汇报环节，受部分同学表达能力的影响，学生的注意力不容易集中，课堂进展的节奏会略显拖沓。在教学过程中容易出现两极分化的现象，部分学生的主动性得到了很好的发挥，综合能力得到了比较充分的锻炼，也有个别学生在混学分，并没有进行真正的自主学习。且教师对新的教学方法的理解和掌握的程度也一定程度上影响了学生的学习效果。在评价体系中，给学生公正、全面、合理的评价影响着学生的学习态度和热情，但其过程是相当烦琐的，需要教师团队比较多的精力投入，适当的激励机制能更好地配合教学改革的推进。
三、展望
采用MTT法绘制细胞生长曲线。取第7代近融合的肠上皮细胞,消化后调整细胞密度为1×105/mL的单细胞悬液,接种于96孔板中,每孔接种100μL,接种15板,每3d更换一次细胞培养液。每天于相同时间取出一板细胞,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL,培养4h后,吸出孔内上清,每孔加入二甲基亚砜150μL,震荡10min后于酶联免疫检测仪以490nm波长测吸收值。共测定15d,以时间作为横坐标,光吸收值(D)作为纵坐标,绘制细胞生长曲线。1.8流式细胞术(flowcytometry,FCM)分析细胞周期常规方法收集第7代近融合的肠上皮细胞,PBS洗涤2次,在离心管中留约0.5mL的PBS,向细胞悬液中缓慢加入75%冰乙醇,–20°C固定过夜。检测前,1000r/min离心3min去除乙醇,PBS清洗1次,加入适量碘化丙啶染液(0.1%TritionX-100,10μg/mL碘化丙啶,50μg/mLRNase),室温避光染色30min,上机检测,计数10000个细胞,用MuticycleAV软件进行DNA细胞周期拟合分析。增殖指数(proliferativeindex,PI)指增殖细胞占总周期细胞的比例,S期细胞指数(S-phasefraction,SPF)指细胞周期中处于S期细胞所占的比例。采用PI和SPF分析细胞的增殖活性,PI(%)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%,SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。1.9染色体核型分析参考已报道的方法[13],稍作修改。传代细胞以1×105/mL的密度接种至96孔板。48h后换液,给予浓度为2μg/mL秋水仙素处理3h;消化收集细胞,37°C低渗(0.075mol/LKCl)处理20min;用新鲜配制(4°C预冷)的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)预固定20min,离心去除上清,再视细胞量加入新鲜固定液0.5~1mL,以移液枪重悬沉淀;取出–20°C预冷的玻片,30cm高度滴片;空气干燥,吉姆萨工作液染色10min,脱色,在显微镜下选择分散良好,形态清晰的染色体中期分裂相,进行拍照,用Photoshop软件进行染色体核型分析。
2结果
2.1IEC-P.A.的细胞形态与超微结构
用嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶联合消化参环毛蚓肠组织,获得的大量隐窝单位和散在细胞。隐窝单位培养48h即能贴壁,72h开始辐射出零星细胞;而散在的肠上皮细胞贴壁所需时间较长,接种一周才可形成少量的细胞集落(图1A),15d开始贴壁,但附着不稳定,稍振动即浮起。约28~30d细胞生长至85%~90%汇合,可进行传代培养。原代培养时有较多的细胞碎片,且上皮细胞与成纤维细胞夹杂生长,传至第3代以后,细胞碎片明显减少,类圆形上皮细胞数量增多,形态较一致。传代后细胞生长稳定,培养13~15d可见肠上皮细胞汇合成细胞单层,呈典型“铺路石样”镶嵌排列,边界清晰,互不重叠(图1B)。透射电镜下观察培养的肠上皮细胞,可见细胞结构完整,直径为8±2μm,具有典型的肠上皮隐窝细胞特征。微绒毛从细胞表面伸出,排列整齐(图2A),近绒毛端胞质中分布丰富的线粒体,其嵴清晰可见(图2B),细胞核周区域有大量的粗面内质网(图2C)。
2.2IEC-P.A.的生长曲线
第7代参环毛蚓肠上皮细胞的生长曲线见图3,体外培养的肠上皮细胞存在着明显的潜伏期,接种培养7~9d后才能进入对数生长期,经过大约4d的对数生长期后,至13~15d开始进入平台期,且能相对较长时间维持在这一时期。
2.3FCM分析IEC-P.A.细胞周期
参环毛蚓肠上皮细胞的细胞周期检测结果见图4,细胞各个时期的分布状态是G0/G1期为(93.13±0.12)%,S期为(3.73±0.23)%,G2/M期为(3.14±0.17)%,细胞的增殖活性指标PI为6.87%,SPF为3.73%。由此可见,体外培养的肠上皮细胞接种后,相对较长时间处于静止期,尚未进行增殖分裂活动。
2.4IEC-P.A.染色体核型分析
本实验所培养的肠上皮细胞来源于环节动物门的参环毛蚓,具有一定的特殊性,与常规哺乳动物的细胞差异较大。处于中期分裂相的肠上皮细胞所占比例较少,且处于分散状态的染色体臂常常出现部分重叠(图5A),但尚可应用Photoshop软件进行核型分析。根据所拍摄的20个细胞的中期分裂相,可以得出,参环毛蚓肠上皮细胞的染色体数为2n=22,其中第1、2、5、8、9、11号染色体为中部着丝粒染色体,第4、7、10号染色体为亚中部着丝粒染色体,第3、6号染色体为亚端部着丝粒染色体,其染色体核型可表示为n()=x=6m+3sm+2st(图5、表1)。整体来说,第3代参环毛蚓肠上皮细胞染色体没有异常表现,基因组相对稳定。
3讨论
体外培养的肠上皮细胞对于研究营养物质的吸收代谢机制、药物作用以及各种致病因素作用下的生理病理改变具有重要意义,所取得的研究成果可以为人工养殖活动提供科学指导,从而带来巨大的经济效益[14]。目前,蚯蚓种属肠上皮细胞培养与生物学特性研究尚未见报道。本研究采用混合酶消化法对参环毛蚓肠上皮细胞进行分离培养,稳定传至第8代,并研究了细胞形态、超微结构、生长曲线、细胞周期和染色体核型等生物学特性,成功获得参环毛蚓肠上皮细胞系(IEC-P.A.)。不仅丰富了环节动物门的细胞资源及相关生物学特性资料,而且所建立的细胞培养技术及生物学特性检测方法可以为蚯蚓种属细胞培养及研究提供参考。分离肠上皮细胞常用的消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、嗜热菌蛋白酶及中性蛋白酶。由于来源动物不同,关于各种消化酶的分离效果有不同的报道,其中嗜热菌蛋白酶分离肠上皮细胞可获得大量的健全绒毛隐窝单位,且传代后增殖能力比较稳定[15-17]。本实验参考上述条件,对消化酶进行了适当调整,筛选确定嗜热菌蛋白酶和I型胶原酶的混合酶液较适合分离参环毛蚓的肠上皮细胞。所得细胞悬液可见大量肠上皮细胞特有的隐窝单位。细胞鉴定是肠上皮细胞培养过程中一个重要内容。除了观察形态特征外,常用的有碱性磷酸酶染色法、电镜法及免疫荧光染色法[18]。由于碱性磷酸酶染色法影响因素复杂,阳性率低;又因亲缘性的关系,参环毛蚓肠上皮细胞缺少特异性标记物,而无法使用免疫学鉴定,所以本研究选取了透射电镜观察参环毛蚓肠上皮细胞的超微结构。细胞表面可见大量微绒毛,胞内含有丰富的线粒体、粗面内质网,符合肠上皮细胞的特征。应用流式细胞技术,对核酸染料标记的DNA进行检测,能够得到细胞各个时期的分布状态,通过计算G0/G1、S、G2/M期的百分数,可以进行细胞周期分析,了解细胞的增殖能力[19]。常规测定时多选用碘化丙啶染料对DNA染色,但本实验中发现碘化丙啶不能对75%冰乙醇固定的参环毛蚓肠上皮细胞的DNA进行染色。分析其原因可能是碘化丙啶无法进入参环毛蚓的细胞内所致。为此,本团队通过添加不同浓度TritionX-100进行破膜,最终选取的染色液组分为0.1%TritionX-100、10μg/mL碘化丙啶、50μg/mLRNase,使FCM分析参环毛蚓IEC细胞周期的检测得以顺利进行。但结果中变异系数(coefficientofvariation,CV)值、细胞碎片含量(%Debris)较高,表明此破膜染色方法还有待于进一步优化。S期细胞比率(SPF)和增殖指数(PI)均可以反映细胞群体的增殖状态和DNA的合成速度,因此常用它们的大小来表示细胞增值活性的高低[20]。
细胞凋亡采用FITC-PI双染色方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液，每管加入10μLFITC溶液，避光孵育30min后，每管加入10μLPI溶液，C6流氏细胞仪每管抽取10000个细胞进行分析。实验重复6次。细胞迁移及侵袭能力采用Transwell小室方法检测。制备转染后的GSCs细胞悬液，以每孔100μL含51×10细胞数接种于Transwell小室的上室，下室加入500μL高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清），48h后取出小室，PBS清洗上室内的细胞，室温晾干后4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗3遍，至于吉姆萨染色液中染色30min，取出室温晾干后，置于显微镜直接观察拍照，随机选取5个视野计数染色细胞个数。细胞侵袭能力检测需在Transwell小室的上室内预先铺置基质胶，置37℃、5%CO细胞培养箱中26h后备用，余步骤与细胞迁移实验相同。实验重复6次。统计分析用SPSS18.0统计软件对数据进行处理。实验数据用表示，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析和Bonferroni检验，<0.05认为有统计学差异。
2结果
2.1U87来源的GSCs的鉴定
如图1A所示，U87细胞置于干细胞培养基培养后形成细胞球，此细胞球同时表达Nestin（神经干细胞标志物）及CD133（肿瘤干细胞标志物），在图1B中，细胞球在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行分化培养2周后，细胞表达胶质细胞活化的典型标志物GFAP，以及神经元的典型标志物tubulinIII。以上结果说明在干细胞培养基形成的细胞球细胞为典型的胶质瘤干细胞，具有神经系统肿瘤干细胞的特征，并且具有多向分化能力。
2.2在GSCs中，miR-144呈现低表达状态
如图2所示，Real-timePCR结果显示，与non-GSCs相比，在GSCs中miR-144的表达明显降低（<0.01），说明miR-144可能参与了脑胶质瘤的发生和发展。
2.3转染后，miR-144的表达
如图3所示，在pre-miR-144组中，miR-144的表达显著提高（<0.01），而在anti-miR-144组中，miR-144的表达显著降低（<0.01）。
2.4过表达miR-144降低GSCs的细胞活力
如图4所示，在pre-miR-144组中，GSCs的细胞活力显著降低（<0.01），而在anti-miR-144组中，GSCs的细胞活力显著提高（<0.01），但是在pre-NC组和anti-NC组中，GSCs的细胞活力与对照组比较无统计学差异。
2.5过表达miR-144促进GSCs凋亡
如图5所示，在pre-miR-144组中，GSCs的细胞凋亡率显著增加至15.6%（<0.01），而在anti-miR-144组中，GSCs的细胞凋亡率显著下降到3.6%（<0.01）。但是在对照组，pre-NC组和anti-NC组中细胞凋亡率分别为8.1%，7.9%和7.9%，三组间无统计学差异。
2.6过表达miR-144抑制GSCs的细胞迁移及侵袭
如图6所示，在pre-miR-144组中，细胞的迁移能力显著降低（<0.01），而在anti-miR-144组中，细胞的迁移能力显著提高（<0.01）。但是在pre-NC组和anti-NC组中，细胞迁移能力与对照组比较无统计学差异。此外，在细胞的侵袭能力检测中，我们得到了相似的结果。
2.7MiR-144靶基因的预测
如图7所示，我们经过查阅生物信息学预测软件Targetscan、Pictar和RNAhybrid等，发现有众多基因存在miR-144的结合位点，经查阅文献得知其中X染色体连锁锌指转录因子（ZFX）和酪氨酸激酶受体（TEK）与GSCs的发生展有着密切的关系。
3讨论
