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序论：在您撰写单摆实验报告时，参考他人的优秀作品可以开阔视野，小编为您整理的7篇范文，希望这些建议能够激发您的创作热情，引导您走向新的创作高度。
（安徽医学高等专科学校，安徽 合肥 230061）
【摘要】血红蛋白含量测定是医学检验专业实验课中的重要内容。本文通过对国内外学者近年来的研究成果的综述，使学生了解血红蛋白含量测定的最新科研动态，并掌握几种简单实用的测定方法。
关键词 血红蛋白含量；测定；评价
0 前言
血红蛋白是由珠蛋白、亚铁血红素等组成,作为红细胞内的一种机能蛋白，在生物体内起到传输氧气、传递电子等功能，与氧和能量代谢有关的重要活动。在临床上出现各类贫血、白血病及心脏病等症状常与血红蛋白异常有关，因此，人体血液中和尿液的血红蛋白含量的测定是临床检测的一个重要内容。通常用血红蛋白内的珠蛋白和亚铁血红素在血液中的总浓度来表示。血红蛋白成分的评价应用范围较广，其涉及动物学、医学、体育学、生物工程学等领域。目前，随着检验技术的飞速发展和医疗器械的不断改进，目前，血红蛋白含量检测方法主要有比重法[1]、比色法[2]721分光光度仪法[3]、光电比色[4]、电流阻抗法[5]、胶体金法溶血测试条[6]等6个不同方法测定。
1 比重法
比重法是血红蛋白测定的最原始的方法，在血库或大量的献血员采血时为了节约时间，看是否贫血，在硫酸铜溶液中加入一滴于溶液中，通过其浮力方法是否大于排开水的重量如果沉入杯底，可以献血，血滴漂浮为贫血。通过血滴在水中的比重变化来观察人体是否贫血，此方法是基于对血滴重量和在水中浮力进行测量，通过肉眼观察，粗略估计而得出的。是依据阿基米德原理，血红蛋白是由各种亚铁血红素等构成的，血红蛋白内珠蛋白和亚铁血红素的量多少，直接影响血红蛋白含量多少，因此通过血红蛋白比重法可推算出是否贫血。该方法不需要特定的设备，操作简单，但准确度低，没有准确的文字描述，不适合推广。只用于一般体检且对受试者体能状况有一定的要求，故对体质较弱的人群不要采用。
2 血红蛋白目测比色法
血红蛋白目测比色法是对比重法的替代，此测定器材包括两个部分，一个是比色管，一个是参照比色槽。取0.1mol/L稀盐酸溶液2-3滴加于比色管中，再加20ul血液于比色管中，混匀、静置15分钟，不断加蒸馏水于亮光处与比色槽颜色相对照一样，液体的高度即可读取刻度即血红蛋白含量。由于指定颜色与刻度存在对应关系，进而可以推算出受试者的血红蛋白浓度。比色法的优点是受试者可以准确知道血红蛋白含量。缺点是目测视觉易产生读数误差，不利于大量标本测定。适合乡镇卫生院，诊所等。
3 721分光光度法
血红蛋白含量在比色法测定时不太稳定都是定性分析，不易于定量数值观察，易于出现误差，721分光光度仪法：取氰化高铁血红蛋白转化液5毫升加入20微升血，混匀后静置5分钟，混匀后倒入比色杯中，转化液调零，利用其在540纳米波长下，测定其吸光度。但此法需要（50 g/L、100 g/L、150 g/L、200 g/L）血红蛋白标准液校正其K值，不然其测定结果乘以367.7就有误差。此法可以反映血红蛋白含量情况，因其试剂、仪器干扰因素比较多测定时存在一定误差，但该方法简便易行，基层卫生所、乡镇卫生院、实验室单个检测用，缺点：不利于普查。
4 血红蛋白仪光电比色法
江苏生产的XK-Ⅱ型血红蛋白仪是依据郎伯-比尔光吸收定律，利用光电比色原理测定血红蛋白含量的专用检测仪器。测定方法，调零、校正取一只试管加入氰化高铁血红蛋白100 g/L标准液仪器校正后，定标、测试，5毫升转化液加入20ul血液混匀静置5分钟后，在把溶液混匀，吸管插入试管底部，按键即可。此种方法显示数字“三位”，测量范围：0-200g/L,时间测定＜8秒。线性误差当样品＜0-100g/L时，±2g/L;样品＞100g/L时，±2g/L，温度控制在5℃—35℃。XK-Ⅱ型血红蛋白仪法适合大范围普查，目前在国内院校学生体检被广泛应用。缺点，不能自动记录所测得血红蛋白含量的数据，做完标本吸掉不利于再分析，也不利于数据自动分析统计。
5 库尔特电阻抗法
全自动血球分析仪在全世界广泛应用比较普及，其应用最多仪器原理是电流阻抗法，其利用血细胞与稀释液相比是相对不良导体当血细胞悬浮电解质溶液中，将小孔管插入细胞悬液，使其小孔管内加入溶血剂后，红细胞溶解释放出血红蛋白，并与溶血剂中有关成分形成血红蛋白衍生物，在540nm特定波长下比色，吸光度与血红蛋白含量成正比，可直接反映血红蛋白浓度。电流阻抗法还能对血红蛋白含量以外的其他成分如白细胞、血小板等成分测定, 这是其它测定技术无法办到的，该法比常用的比色法、比重法测定方法结果精确可靠, 而比721分光光度法等在实验室技术成本、难度高、安全无创伤, 比较适用于大型医院，群体人群实验科学研究应用, 对诊断贫血、监测慢性病人等疾病有重要价值。目前也在医疗康复机构、营养研究机构、健身俱乐部、都在普及使用。它的操作过程简单易行, 对那些用血红蛋白难以测定的人群如儿童、老人、病人更为实用。缺点:一般家庭不能普遍使用。二：定试条费用比较高, 应用仍有局限性。随着电阻抗技术的不断发展，已有全自动、手提式半自动分析仪并用式测定仪问世。
6 胶体金法溶血测试条
胶体金法溶血测试条是对在血液输血中血液制品中游离血红蛋白含量多少测定的应用，来判断血液制品质量和安全输血的重要指标之一，也是一种快速筛查方法。方法按照《全血及成分血质量要求》，全血保养液为ACD-B时血浆中游离血红蛋白浓度≤0.29g/L、全血保养液为CPDA-1时血浆中血红蛋白≤0.72g/L 和解冻红细胞游离血红蛋白含量≤1.00 g/L的标准，该法适合在大、中医院或血站对血液制品中游离血红蛋白含量的快速筛查。现在血站用于血液制品中血红蛋白的检测方法，大多采用经典邻甲苯胺法，但由于该方法中的邻甲苯胺具有致癌性作用，针对这一问题已有许多学者对血浆中游离血红蛋白检测的其他方法进行了大量研究。胶体金免疫层析法( GICA)是其原理是将胶体金标记、免疫检测和层析技术三者有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，因其操作快速、简便、稳定性好、特异性强、实验条件不易被污染和要求不高等优点，特别是随着近几年来胶体金技术的发展，该方法的检测已可达到纳克级的水平。
7 结语
综上所述, 血红蛋白含量测定方法到目前来说比较多，每种测定方法都包含该种方法原理、精准性、操作性、安全性、对适用不同人群在价格等方面存在较大差异。选取适宜的测定方法，对血红蛋白含量的测定、研究也具有一定的重要意义。目前对血红蛋白含量测定还没有一种既简单又精确的理想方法。所以我们要在今后的实际操作工作中，可根据不同的目的选用不同的测定方法。
参考文献
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基金项目：国家重点专科建设项目；国家自然科学基金（81272150）；广东省自然科学基金项目（S2011010002576）；广东省科技计划项目（2010B031600112，2012B031800308）
作者单位：510055 广州，南方医科大学研究生学院（黄林强、曹卫、解迪、韩永丽）；广东省人民医院 广东省医学科学院急危重症医学部（曾红科、邓医宇、方明、温妙云、朱高峰）
通信作者：曾红科，Email：
【摘要】目的 在体外细胞实验中探讨高渗盐水（hypertonic saline， HS）是否影响小胶质细胞的激活及释放单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1， MCP-1），以及其潜在的机制。方法 体外混合培养原代胶质细胞，利用摇床震摇的方法纯化分离小胶质细胞，分为对照组、缺氧+无糖培养基组（简称缺氧组）、缺氧+无糖培养基+100 mmol/L HS组（简称HS组）及SB203580组（p38信号通路特异抑制剂）。除对照组外，其他各组均进行氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation， OGD），利用免疫荧光及ELISA方法检测HS对小胶质细胞生成及释放MCP-1的影响，并使用Western blot方法检测HS是否可影响p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）蛋白的磷酸化水平。数据采用单因素方差分析，用LSD法进行组间两两比较，P
【关键词】 高渗盐水；脑水肿；缺氧；小胶质细胞；单核细胞趋化蛋白-1；p38； SB203580；炎症反应
Hypertonic saline decreases monocyte chemotactic protein 1 expression in microglia may be through inhibition of p38 MAPK signaling pathway Huang Linqiang， Deng Yiyu， Cao Wei， Zhu Gaofeng， Wen Miaoyun， Xie Di， Fang ming， Han Yongli， Zeng Hongke. South Medical University， Guangzhou 510515， China
关键词玉米；盐溶蛋白；聚丙烯酰胺凝胶电泳；种子纯度
玉米是世界四大粮食作物之一，播种面积仅次于水稻和小麦。我国的玉米面积稳定在2 000万公顷左右，目前几乎全部是杂交种。从1993年的数据看，虽然播种面积比1992年减少了34.94万公顷，但产量却增加了732.1万吨（刘江等1994）[1]。玉米产量的提高当前主要是依靠优良杂交种的普及，而推广优良的杂交种需要大量优质种子。我国每年杂交玉米种植124.47万公顷左右，需用杂交种8~9亿千克以上[2-3]。杂交种中每混杂1%的自交系种子就会减产0.6%，种子纯度每提高1个百分点，可以增加产量225 kg/hm2，可见种子纯度的提高对玉米产量的增加具有重要的意义[4]。
品种纯度是指某一品种群体在特征、特性方面典型一致的程度，它是种子质量评价的重要指标，直接影响作物丰产性、稳定性、整齐一致性和抗性[5]。种子纯度检验包括真实性鉴定和纯度检验两个方面，其实质都是鉴定种子的基因型。目前，国内外普遍采用的鉴定方法有：形态学方法、生化方法和分子生物学方法[4，6]。盐溶蛋白电泳法鉴定玉米品种的纯度是基于玉米品种间蛋白组成的差异。该方法具有准确性高、分辨能力强、速度快、经济便捷、不受环境影响等优点，因而被列为行业标准（NY/T449-2001）[7]。本试验采用国标的方法鉴定玉米种子纯度，并分析了影响玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺电泳分离效果的主要因素及电泳操作中应注意的问题，为玉米纯度鉴定工作提供信息和依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料。玉米种子：益丰2号，冀农61号，泛玉2号，科河8号。
1.1.2试剂。丙烯酰胺、N-N＇亚甲基双丙烯酰胺、乳酸、乳酸钠、甘氨酸、抗坏血酸、氯化钠、蔗糖、甲基绿、三氯乙酸、过氧化氢、考马斯亮蓝R-250、冰醋酸、无水乙醇（化学试剂均为分析纯，水均为去离子水）。
1.1.3仪器。电泳仪（500±5V连续可调、0~400mA连续输出功率200W）、垂直板夹心式电泳槽、单粒粉碎器、天平（0.01g、0.001g、0.000 1g各1台）、pH试纸、高速离心机（5 000r/min以上）、电冰箱、微波炉、离心管（1.5mL）、离心管架、微量进样器、量筒、烧杯、玻璃棒。
1.2方法
1.2.1样品制备。参照国标（NY/T449-2001）作适当改进：从各样品中随机取种子，用单粒粉碎器粉碎，加入1.5mL离心管中，用滴管加入与样品体积相同的样品提取液，摇匀，放置5min后，再摇1次，30min后，用离心机5 000r/min离心15min，取上清液用于电泳。
1.2.2 凝胶制备。按照《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》（NY/T449-2001）规定制备。分离胶：丙烯酰胺11.25%，双丙烯酰胺0.375%；浓缩胶：丙烯酰胺6%，双丙烯酰胺1%。
1.2.3电泳。在500V电压下稳压电泳，待甲基绿指示剂移至胶底部边缘时，关闭电源。
1.2.4染色。倒出电极缓冲液，取出胶室，卸下胶条，启开玻璃板，取出胶片，浸入染色液中，室温染色4h。若希望染色速度加快，也可适当提高温度。
2结果与分析
2.1玉米盐溶蛋白的谱带特征
大多数种子贮藏蛋白在多基因位点上编码，基因产物显示几条蛋白带（黎裕，1990）[8]。在品种鉴定中，可根据特定蛋白带的有无或者在电泳凝胶上某一位置出现的谱带评价其特异性（见图1）。不同的玉米品种由不同的蛋白质组成，所以表现在电泳谱带上就有不同的谱带类型，玉米盐溶蛋白电泳就是利用这些差异来鉴定品种的。
玉米盐溶蛋白电泳谱带可根据分子量大小划分为3个区域：α区、β区、γ区。α区由小分子量蛋白质组成，β区由中分子量蛋白质组成，γ区由高分子量蛋白质组成。
β区为主要的谱带区域，该区域中蛋白质谱带数量多，染色深，品种间差异大，为纯度鉴定中主要应用区。
α区为次谱带区域，该区域中蛋白质谱带数量少，谱带扩散，染色浅，品种间差异不太显著。在纯度鉴定中，当β区域谱带差异不明显时，可根据α区域的谱带差异进行鉴定。
γ区为辅助区，该区域中蛋白质谱带数量多，染色谱带细，易受电泳条件影响。对于虫蛀、发霉、生病的籽粒，该区域谱带会部分或全部消失。在该区域品种间差异较小，不太容易观察，最好不作为纯度鉴定时用。如果α区和β区无差异，只有γ区有差异时，最好严格控制操作条件，以达到良好的重复性[10]。
该品种α区和β区很明显，谱带多态性丰富，图谱清晰，分辨率高，它的主要谱带区域即β区很明显。因此，我们以后用此方法鉴定玉米纯度时，主要看β区的明显特征，如果不清晰，再看α区特征，对于γ区可以不作为鉴定标准。我们可以设想，给每个地方的品种建立一个凝胶电泳图谱库，把每个品种的特征谱带找出来，这样鉴定种子纯度时就可以从图谱中直接查找匹配的图谱，以快速鉴定，并且可以判断出混入了哪些品种[10]。
2.2玉米盐溶蛋白电泳的影响因素探讨
2.2.1玉米盐溶蛋白的提取。提取样品中的蛋白质时提取液加入后要充分摇匀，然后进行离心。本实验通过对比发现，提取液加入后充分摇匀，放置10min左右再摇匀1次，再离心提取的效果较好，蛋白的提取量较高，电泳的谱带较丰富。
2.2.2提取时间对电泳效果的影响。保持凝胶组分的浓度不变，将提取时间改变。结果表明，提取时间太短，蛋白浓度太低，染色后，谱带颜色较浅，影响分辨率；提取120min后，部分蛋白质水解，谱带丢失；提取时间分别为30min和50min时，蛋白质组分多态性丰富，谱带清晰，分辨率高。因此，一般提取时间选为30~50min之间。
2.2.3提取液放置4℃冰箱对电泳分离效果的影响。将提取35min、离心10min后的样品放置于4℃冰箱，1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d后分别对此样品进行电泳，结果表明，放置后，电泳谱带没有变化，可以继续使用，这与张春庆等做的结论是一致的[11]。因此，在实际工作中既可提前提取，也可在电泳前提取。
2.2.4提取液用量对电泳结果的影响。在样品制备中，加入不同体积的提取液。提取液加入过多，电泳谱带颜色较浅，原因是样品中蛋白浓度低，因此染色较浅；提取液加入太少，加样时微量加样器会吸取到少量种子面粉颗粒，导致谱带颜色过深。
2.2.5过氧化氢加入量对凝胶聚合速度的影响。过氧化氢作为凝胶聚合的加速剂，对凝胶聚合速度有直接影响，其加入量越大，凝胶聚合越快。本实验对过氧化氢加入量设置不同组合，验证它对电泳结果的影响，同时找出最佳的过氧化氢用量。结果表明，选用6mL浓缩胶中加入50μLH2O2，18mL分离胶中加入25μLH2O2时，电泳效果较好，谱带清晰。一般随着催化剂用量的递增，缩短凝胶聚合时间，进样小井残留液减少，凝胶板硬度略有增加，在以后的操作中不易破裂。
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2.2.6凝胶粘板。主要是玻璃板不干净。因此，清洗玻璃板时首先要用软毛刷把板上的凝胶清除干净，避免划拨玻璃板，然后再用海绵等软的物品清洗，清洗干净后要用蒸馏水冲洗两面，垂直放在玻璃板架上自然晾干。若粘板严重要更换新的玻璃板[12]。
2.2.7谱带的弯曲现象。灌分离胶时加过氧化氢进行催化，若过氧化氢在分离胶中分布不均匀，会导致胶体聚合不匀而引起谱带弯曲。在灌分离胶时，一定要充分搅拌，用力摇匀后再灌[13]。
3讨论
大多数种子贮藏蛋白在多基因位点编码，基因产物显示几条蛋白带（黎裕，1990）[7]。在品种鉴定中，可根据特定蛋白带的有无或在电泳凝胶上某一位置出现的谱带评价其特异性。玉米盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定玉米种子纯度，谱带多态性丰富，且结果与田间种植纯度鉴定方法结果一致[14]。因此，盐溶蛋白PAGE法可以作为玉米纯度检验的可靠方法。标准的、实施给种子质检中心、广大种子经销商提供了一套快速、实用的室内纯度检测方法，具有成本低、速度快、鉴定周期短等特点，解决了种子流通领域过程中经常出现的种子质量问题，避免了不必要的损失，减轻了农民负担。该方法具有田间种植不可比拟的优越性，对于广大使用者来说具有重要的应用价值，同时也创造了较好的经济效益和社会效益。但是，任何一个标准的推广应用都是一个不断修改、补充、完善的过程，随着时间的推移，本标准将会逐步完善并且越来越显示其重要的应用价值[15]。
4参考文献
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血液中的白细胞(WBC)是人体血液中具有防御和免疫功能的重要细胞，它来源于骨髓中的原始和幼稚血细胞，在骨髓里发育为成熟细胞后释放到血流中。正常人每微升的血液中有白细胞4000～9000个。按国际标准制，要求用每升中的数量来表示，于是就成了(4～9)×109／升。
白细胞升高分为生理性升高和病理性升高。
白细胞的生理性升高常在进餐后、激烈运动后或受精神打击后，以及女性的月经期、妊娠后期等，但通常不会高于14×109／升。
白细胞的病理性升高的原因很多，主要是体内有组织损伤或有炎症。分析白细胞升高的原因时一定要结合白细胞分类的化验结果。人体的白细胞分成五类。
1．淋巴细胞(Lym或L)。它的主要功能是参与多种免疫反应，是重要的免疫细胞。成人的淋巴细胞占白细胞的20％～30％，儿童约占30％～40％，婴儿可达50％。当人体受到病毒感染时常见升高，还会出现形态异常的淋巴细胞。患百日咳、传染性单核细胞增多症、淋巴系统的炎症、结核病等会明显升高。当体内有炎症或组织损伤但正在恢复期时，也会升高。患淋巴细胞性白血病或淋巴瘤时会明显升高，且在血液中出现原始或幼稚的淋巴细胞。
2．单核细胞(Mono或M)。它的主要功能是吞噬侵入人体的细菌或病毒等病原体，并清除体内的死亡细胞碎片。单核细胞占白细胞的2％～8％。当体内有慢性炎症、病毒感染、风湿病或结核病等情况时常会升高。
3．嗜中性粒细胞(也称嗜中性多核粒细胞，N或Poly)。它占白细胞的60％～70％，对白细胞总数的升高或减少影响最大。它的功能是防御病原体感染并可吞噬或杀灭病原体，是人体主要的防御细胞，所以当身体有炎症或组织损伤时，首先动用的是嗜中性粒细胞，故先有升高。细菌性炎症常比其他炎症升高得明显。当炎症恢复或好转时它可下降而至正常范围。有些炎症，尤其是老年人的炎症常有白细胞总数并不高，但嗜中性粒细胞升高的情况出现。所以不仅要看百分数，还要看这类细胞的量数。现在的化验报告都同时报告百分数和计数结果。应仔细查看。
4．嗜酸性粒细胞(Eosin或E)。它占白细胞的1％～4％。在过敏性疾患、皮肤病、寄生虫病、嗜酸性粒细胞增多症时升高，但由于所占比例较小，一般对总数影响不大。
摘 要：我们完成了对多种生物活性分子探针的化学修饰，为下一阶段的应用研究奠定了探针基础。首先，在细胞膜通透性方面，发现我们的核酸分子探针，由于其高度的化学修饰和较短的链长，已经实现了不需特殊修饰保护，即具有在活细胞中的稳定性和一定的通透性。其次，我们利用亚克隆技术在体外将一种酵母菌中亚铜离子结合蛋白Ace1的关键区域插入到黄色荧光蛋白（YFP）构建4种不同的模型中，有效提高了其荧光强度；我们将此传感器成功应用于检测细胞体内亚铜离子浓度。通过体外和体内的验证，我们研发的亚铜离子荧光传感器可以应用于研究生物体系内铜离子的代谢研究。最后，对拟南芥根表皮细胞质膜铵转运蛋白（AMT1；3）进行了活体动态分析。研究发现：AMT1；3-EGFP在正常供铵状态下，在质膜上的运动状态主要有两种：一种是出现后立即消失；另外一种是在膜上停留一段时间后消失；并且发现AMT1；3-EGFP在不同铵浓度下，这两种运动状态的荧光点所占的比例不同，表明铵浓度决定AMT1；3-EGFP的膜表面停留时间。更重要的是，高铵胁迫下会引起AMT1；3-EGFP聚合并内吞，而这种内吞对于调控AMT1；3的转运活性发挥着重要的作用；并且高铵所引起的快速内吞作用是由铵根离子特异引起的。
关键词：探针 亚铜离子 铵转运蛋白 可变角度的全内反射荧光显微镜 内吞
Abstract： We have developed a novel affinity labeling method based on DNA-templated photocrosslinking chemistry. DPAL uses a modular system to dissect binding from other functions that are usually combined in one probe， therefore simplifying probe design and preparation. Structure-activity relationship information on acceptable modification site on the SM is still required as any affinity probes. Then， we report a genetically encoded copper（I） probe capable of monitoring copper fluctuations inside living cells. We insert the copper regulatory protein Ace1 into a yellow fluorescent protein， which selectively binds copper（I） and generates improved copper（I） probes. To study how AMTs are regulated in the presence of ammonium， we used variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy and fluorescence cross-correlation spectroscopy for single-particle fluorescence imaging of EGFP-tagged AMT1；3 on the plasma membrane of Arabidopsis root cells at various ammonium levels. We demonstrated that AMT1；3-EGFP dynamically appeared and disappeared on the plasma membrane as moving fluorescent spots in low oligomeric states under N-deprived and N-sufficient conditions. Under external high-ammonium stress， however， AMT1；3-EGFPs were found to amass into clusters， which were then internalized into the cytoplasm. A similar phenomenon also occurred in the glutamine synthetase mutant gln1；2 background. Single-particle analysis of AMT1；3-EGFPs in the clathrin heavy chain 2 mutant （chc2 mutant） and Flotllin1 artificial microRNA （Flot1 amiRNA） backgrounds， together with chemical inhibitor treatments， demonstrated that the endocytosis of AMT1；3 clusters induced by high-ammonium stress could occur mainly through clathrin-mediated endocytic pathways， but the contribution of microdomain-associated endocytic pathway cannot be excluded in the internalization. Our results revealed that the clustering and endocytosis of AMT1；3 provides an effective mechanism by which plant cells can avoid accumulation of toxic levels of ammonium by eliminating active AMT1；3 from the plasma membrane.
Key Words： Probe； Copper（I）； AMTs； VA-TIRFM； Endocytosis
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【摘要】 本研究确定人急性单核细胞白血病细胞系SHI1在裸鼠体内的高致瘤性，并对其成瘤机制进行初步探讨。将SHI1细胞接种至裸鼠皮下，观察肿瘤生长情况；取肿瘤组织行病理检测、R显带核型分析；RTPCR检测MLLAF6融合基因和VEGF基因的转录；明胶酶谱法检测培养上清中基质金属蛋白酶9（MMP9）和MMP2的表达；体外穿膜实验观察迁移能力。结果表明： 注射SHI1细胞的16只裸小鼠均于皮下出现肿块；瘤体由白血病细胞组成；注射的裸鼠中有MLL/AF6融合基因和VEGF基因的转录；在无血清培养上清中MMP9和MMP2的表达明显高于对照细胞；SHI1细胞有较强的迁移能力，MMP2的阻断抗体可显著抑制其体外迁移能力。结论：SHI1在裸鼠体内有极高的成瘤率，其机制可能与p53基因的异常、高水平VEGF基因的转录、金属蛋白酶的高表达和较强的体内浸润能力有关。
【关键词】 急性单核细胞白血病
High Tumorigenicity of Human Acute Monocytic Leukemic Cell Line SHI1 in Nude Mice and Its Mechanism
Abstract
This study was purposed to explore the tumorigenicity of a novel human monocytic leukemic cell line SHI1 in nude mice and its mechinism. The tumorigenicity in mice was evaluated in sixteen nude mice subcutaneously injected with the SHI1 cell line. The tumor specimen was studied by the conventional pathologic examination. The mononuclear cells (MNC) of the tumor was assayed by RHG banding，
the transcription of MLLAF6 fusion gene and the VEGF gene was detected by RTPCR. Gelatin zymography method was used to study the expression of MMP9 and MMP2 in the supernatant of the SHI1 cell line. Matrigel invasion assay was employed for the study of migration of the SHI1 cell in vitro. The results showed that the tumor masses were found in all sixteen mude mice after subcutaneous injection of SHI1 cells， the tumor mass was mainly composed of leukemia cells， the transcription of MLLAF6 fusion gene and VEGF gene was proved by RTPCR analysis， the expressions of MMP2 and MMP9 in the serumfree culture supernatant of the SHI1 cell line were significantly higher than those in U937， K562， and NB4 cell lines. The SHI1 cell line exhibited significantly higher in vitro invasiveness than other leukemia cell lines， the blocking antibody of MMP2 could inhibit the migration of the SHI1 cell line significantly. It is concluded that the SHI1 cell line presents higher tumorigenicity in nude mice than other leukemia cell line and the mechanism is associated with p53 gene alteration， high transcription level of VEGF gene， high expression level of MMP， and significantly higher invasiveness.
Key words
acute monocytic leukemia; SHI1 cell line; t(6;11)(q27;q23); tumorigenicity; p53 gene
由于动物模型相对于体外实验而言更接近于人体内的真实情况，建立疾病的动物模型对于深入研究疾病的发生机制和治疗方法有着极其重要的意义。白血病的研究同样也离不开白血病的动物模型。然而大多数白血病细胞系在裸鼠体内的致瘤率非常低，如K562细胞系经体内筛选后所得的亚克隆K562/n才具有较高的致瘤率［1］，HL60和其它常用白血病细胞系的致瘤率也较低。近年本实验室建立了国内第1个以t(6;11)(q27;q23)和p53基因异常为特征的人单核细胞白血病细胞系［2］， 命名为SHI1。我们对SHI1细胞系的致瘤特性及其机制进行了研究。
中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(4)人单核细胞白血病细胞系SHI1在裸鼠体内的高致瘤性及其机制的初步研究材料和方法
裸鼠饲养
取4周龄NC裸鼠4只和BALB/c裸鼠12只，饲育于NASA1000级净化室内，饲料、饮水和笼具等均灭菌后使用，工作人员按无菌规则操作。
SHI1细胞的接种
白血病细胞系SHI1由本所建立，收集对数生长期SHI1细胞，调整细胞浓度为2×108/ml，给每只裸鼠于右侧背部皮下注射100 μl，每日观察注射部位肿瘤生长情况。
肿瘤组织的病理检测
分离裸鼠实体肿瘤组织，常规固定，石蜡包埋、切片，HE染色。光学显微镜下观察、采集图像。
肿瘤组织中单个核细胞（MNC）的分离
无菌条件下分离裸鼠实体肿瘤组织，眼科剪剪碎，碾磨后经100目和200目滤网过滤，将所得细胞悬液收集至无菌离心管，加入适量RPMI 1640培养液， 378×g离心5分钟，弃上清，再加入适量RPMI 1640培养液，吹打、混匀后378×g离心5分钟，弃上清，调整浓度，备用。
核型分析
将由裸鼠肿瘤组织中分离的MNC以1×106/ml的浓度接种于含15％胎牛血清的IMDM培养液中，加入秋水仙酰胺，使终浓度为0.05 μg/ml，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱培养1小时后收获，染色体标本制备和R显带按本室常规方法［3］。核型分析根据《国际人类细胞遗传学命名体制（ISCN）1995》。
MLLAF6融合基因的RTPCR检测
引物序列和PCR反应条件参照文献［4］。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，扫描并分析结果。用于扩增VEGF基因的引物序列分别为: 5′GGG CCTCCGAAACCATGAACTT3′和5′CGCATCAG GGGCACACAG 3′；扩增产物为259 bp。反应体积为50 ml，其中包括: PCR缓冲液，MgCl2 1.5-2.0 mmol/L， dNTPs 0.2 mmol/L， 引物各12.5 pmol， Taq聚合酶1.5 U，逆转录产物4 m·综述·
Mer功能研究进展
范磊，阮长耿
苏州大学附属第一医院江苏血液研究所， 苏州 215006
摘要
Mer是Axl受体酪氨酸激酶家族中的一员，其受体Gas6和Mer结合后可以激活Mer的酪氨酸激酶活性，并激活下游信号传导途径，在细胞炎症、凋亡、血液肿瘤发生发展以及血栓于止血等方面发挥作用。本文主要就近年来Mer的功能研究进展以及Mer的抗血栓和抗血液肿瘤潜在治疗前景进行综述。
关键词
Mer；受体酪氨酸激酶；Gas6；血栓；异位表达
Advance of Study on Mer Function——Review
FAN Lei， RUAN ChangGeng
Jiangsu Institute of Hematology， The First Affiliated Hospital of Suzhou University， Suzhou 215006， China
Abstract
Mer is one member of Axl receptor tyrosine kinase family， and its ligand Gas6 can stimulate activity of Mer receptor tyrosine kinase after binding it， and then activate the downstream signal transduction pathway， Mer participates in cell inflammation， apoptosis， tumorigenesis， thrombosis and hemostasis. Rencet advances of study on Mer function were reviewed， and its potential prospects of antithrombosis and antitumor were discussed in this article.
Key words
Mer; receptor tyrosine kinase; Gas6; thrombosis; ectopic expression
J Exp Hematol 2007; 15(4):892-895
Mer（cMer Nyk Eyk）属于受体酪氨酸家族。此家族还包括Axl和Tyro3两个受体酪氨酸激酶，它们有着共同的配体—Gas6［1］。人类的Mer基因是1994年由Graham［2］首先从人类B淋巴母细胞λgt11的cDNA文库中克隆得到，随后小鼠的Mer基因于1995年同样由 Graham成功克隆，并发现和人类的Mer基因具有88％的同源性［3］。Mer基因的命名主要是基于开始发现其在人单核细胞（monocytes）、上皮组织（epithelial tissue）和生殖系统组织（reproductive tissue）中表达较高。
Mer的生物学性状及其配体
Mer是Axl受体酪氨酸激酶家族的中一员，定位于2q14.1，基因全长为130 755 bp，包括19个外显子。Mer的mRNA共有3 632个 bp，一共编码由999个氨基酸组成的18-20 kD的蛋白［1］。Mer的基因结构和其家族其他两个成员类似，胞外区包括两个IgG样区，两个纤维连接蛋白样区，其中IgG样区为Mer和其配体Gas6结合区域，而纤维连接蛋白样区也在和生长阻滞特异基因6（growth arrestspecific gene 6，Gas6)结合过程中起调节作用［4］。胞内区为酪氨酸激酶样区，具有激酶的活性，并且具有该家族特有的KWIAIES序列。
Mer的配体Gas6是1993年由Manfioletti首先克隆，并发现其氨基酸序列和蛋白S具有44％的同源性［5］。Gas6是1个VitK依赖、由678个氨基酸组成的75 kD的分泌型蛋白，其结构由Gla区、4个EGF样区和2个LaminG样区组成，其中LaminG样区为与其受体结合区域，而Gla和EGF样区也认为参与调节Gas6及其受体的结合过程［6］。
Mer作为受体酪氨酸家族一员广泛表达于多种组织器官和体细胞，在外周血细胞中Mer主要表达于正常的单核细胞和血小板膜上，而不表达于正常的T、B淋巴细胞和粒细胞；组织器官中Mer在、卵巢、前列腺、肺和肾脏组织是高表达的，而在脾脏、胎盘、胸腺，小肠、大肠和肝脏表达较低，而在心脏、脑组织和骨骼肌则没有表达［1］。Graham等［1］和Dirks等［7］分别发现在多种恶性血液细胞株中Mer以及Gas6的异常表达升高，提示Mer可能参与恶性血液病的发生发展过程。
Mer的生物学功能
细胞炎症和凋亡是体内两个重要的生理病理过程。近年来有多篇文章报道Mer与此有关。1999年Todd等［8］将LPS注入Mer-/-小鼠体内，结果发现Mer-/-小鼠有88.2％死于LPS引起的内毒素血症，而对照组只有6.7％的小鼠死亡，同时该小组检测到Mer-/-小鼠体内巨噬细胞分泌的TNFα量明显高于对照组，并且利用TNFα的单克隆抗体可以明显抑制LPS导致的内毒素性休克，提示Mer通过调节巨噬细胞分泌的TNFα来参与LPS导致的内毒素性休克。同时我们也发现在利用LPS、TNFα和IL1β刺激后，人皮肤微血管内皮细胞无论在mRNA水平还是蛋白水平，Mer的表达量都是明显上升的，这一结果也可以从一个侧面证明Mer参与了细胞的炎症反应。
Mer功能研究进展对于凋亡方面的作用，Mer和Axl家族其他成员作用有一定的差别。2002年Guttridge等［9］将构建的EGFR/Mer嵌合蛋白质粒转染到IL3依赖的32D细胞株，并表达此嵌合蛋白，通过利用EGF刺激此嵌合蛋白可以发现Mer导致细胞骨架的结构改变并且抵抗由于IL3撤离导致的凋亡，但并不刺激细胞的增殖，这和其他成员的作用是不同的。然而，将构建的Fms/Mer转染到NIT3T3细胞中则发现Mer具有细胞增殖作用的［10］。同时也应该注意到真正的全长Mer蛋白和EGFR/Mer嵌合蛋白是存在差别的。研究发现，EGFR/Axl可以抵抗32D细胞的凋亡同时刺激细胞增殖，但是利用Gas6刺激转染全长Axl的细胞时此作用并不明显，因此利用全长Mer蛋白进行功能研究也是必需的［11］。
2001年首次发现Gas6和血小板功能相关，利用Gas6敲除（knockout）小鼠发现，被敲除Gas6基因的小鼠可以幸免于尾静脉注射胶原和肾上腺素导致的致死性血栓［12］。2004年Chen等［13］利用Mer敲除小鼠对Mer参与血小板功能做了较为全面的评价，他们应用RTPCR和Western blot证明Mer表达于人和小鼠的血小板膜上，而同家族的Axl和Sky则没有此作用，Mer-/-小鼠的PRP对于低浓度聚集诱导剂诱导的血小板聚集反应较弱，而且敲除Mer基因后同样可以保护小鼠不死于尾静脉注射胶原和肾上腺素导致的肺栓塞。而与此同时Mer-/-小鼠的血小板和野生型小鼠一样可以结合正常数量的可溶性纤维蛋白原，没有自发性出血，并且各种凝血指标以及外周血细胞参数等没有显著的变化。2005年Goul等［14］利用流式细胞术发现Mer、Axl和Sky均表达于人的血小板上，这和Chen等的结论是矛盾的。利用针对拮抗Mer和Sky的单克隆抗体可以有效地抑制体外ADP、PAR1和SFLLRN诱导的血小板聚集达80％之多，而抗Axl的抗体反而促进血小板聚集。由此看来，Gas6/Mer很可能在血栓形成过程中起到信号放大的作用，因为Gas6/Mer本身并不能引起血小板聚集而只是放大聚集诱导剂的作用。目前关于Mer及其家族成员和配体参与血小板黏附和释放功能的研究尚少，并且对于Mer在血栓中的作用研究也只局限于表象，对其内在的机理和相关的信号通路目前也只推测可能通过αⅡbβⅢa参与了血小板活化过程中“自外而内”的信号通路，但并没有相关的深入报道。
Mer在正常的T、B淋巴细胞和粒细胞是不表达的，但是在某些恶性血液病细胞株，如Jurkat、PEER、K562和Raji中有Mer的异常表达［1］，这个现象提示Mer很可能和某些恶性血液疾病有关。
2002年Hogerkorp等［15］利用高通量基因芯片技术发现Mer在外套细胞淋巴瘤中异常表达，并提示可能和此类疾病发生发展有关。2006年Graham等［16］利用流式细胞术和Western blot技术检测了16例儿童急性T淋巴细胞白血病患者，发现其中8例患者骨髓中异常表达Mer，并且高表达组患者白血病细胞表型多为CD3-，CD4-和CD8-，提示表型为幼稚型，而低表达组则多为CD4和CD8单阳性组，较为成熟。2006年Keating等［17］利用转基因技术将Mer异常表达于小鼠的淋巴细胞和胸腺组织，结果发现Mer转基因小鼠脾脏明显增大，并且在12月龄出现体重下降、活动减少和肝脾肿大等症状，24月龄经流式细胞仪检测有55％的Mer转基因小鼠证实罹患淋巴细胞白血病或者淋巴瘤，而野生型组这个比例只有12％。同时体外地塞米松诱导凋亡实验也证实转染Mer的淋巴细胞较野生型的淋巴细胞具有生长优势，提示Mer的抗凋亡效应可能起到作用并促进某些恶性血液病细胞的生长和防止药物诱导的凋亡。
对于实体肿瘤中Mer的表达情况的报道较少，目前研究也主要局限于在某些恶性细胞株中的表达情况。1994年Graham等［2］利用RTPCR的方法证实了Mer在肺癌细胞株A549、上皮瘤细胞株A431中表达较高，而在部分乳腺癌、胶质瘤和膀胱癌细胞株中有低水平表达。2004年Wu等［18］以转染了FMS/Mer嵌合蛋白的前列腺癌细胞株为模型，利用微阵列技术发现特异性的激活Mer活性可以使部分趋化因子表达上调，其中以IL8的上调最为明显，而后者被认为与多种肿瘤发生、转移和血管新生有关。
Mer作用的信号传导通路
目前关于Mer具体的分子信号传导途径的研究还不十分完善。PLCγ，PI3K，Src，Grb2，Raf1以及ERK等下游分子的磷酸化作用可能与Mer的信号传导有关。位于激活Mer分子酪氨酸激酶区域的的Y749，Y753和Y754氨基酸被认为是Mer自动磷酸化的位点，并且Mer分子的完全活化需要三者共同的磷酸化作用［19］。Y749，Y753和Y754三种位点同样存在于同家族的Axl和Sky分子中，提示这可能是该酪氨酸激酶家族激活的重要保守区域。Todt等［20］利用单克隆抗体技术证明，Mer可以激活下游的PLCγ分子，并且与巨噬细胞吞噬凋亡胸腺细胞的过程有关。小鼠Mer酪氨酸激酶区域的嵌合蛋白可以持续激活下游的ERK分子并导致Ba/F3前B淋巴白血病细胞的增殖；实验显示，小鼠Mer的Y867位氨基酸（相当于人类Mer分子的Y872位）可以结合Grb2分子，从而依次激活下游的PI3K以及NFκB分子，而PI3K/NFκB信号途径被认为是与很多细胞的凋亡和分化等重要生理过程有关［21］。另外有报道证实，人类Mer分子的Y872位氨基酸是多个下游分子的结合位点，其中可能包括PLCγ，PI3K，cSrc，Grb2和Lck［22］。Besser等［23］利用点突变技术证明，Mer介导的细胞转化作用是通过激活下游的STAT分子信号途径实现的。虽然有报道Mer氨基酸第933位的LQ突变会明显激活下游的STAT3分子并增加Mer的细胞转化效率，但是还是认为人类的Mer分子主要激活的下游的STAT1分子。除了PI3K/NFκB分子信号途径，Mer也可以通过其他信号通路起作用，利用基因芯片技术筛选的Mer可以强烈地诱导IL8生成，并导致细胞分化，同时也证实Mer介导的IL8上调是通过ERK分子信号途径而不是PI3K/NFκB途径实现的。
针对Gas6/Mer途径的抗血小板药物临床应用前景Mer或者Gas6基因敲除小鼠都显示血小板聚集和血栓形成能力下降，同时没有自发性出血、各种凝血指标和外周血细胞参数正常等现象，因此有人推测Gas6/Mer信号途径可能在血小板聚集中起到信号放大和加速的作用，而其本身并不引起血小板聚集。体外实验也表明，针对Mer的单克隆抗体可以抑制多种低浓度诱导剂引发的血小板聚集。目前传统的抗血小板药物多为抑制血小板“自内而外”的信号传导，比如阿司匹林可以抑制环氧化酶进而抑制血栓恶烷A2的合成；氯吡格雷则通过拮抗P2Y12受体发挥作用。目前抗血小板药物在抑制血小板聚集的同时存在较大的出血风险，因此针对Gas6/Mer等调节途径的新一代抗血小板药物有望成为治疗的新靶点，此类药物的特点就是可逆性抑制血小板聚集而没有明显的出血等副作用，这点已经在基因敲除的小鼠模型中得到证实。
Mer在8例儿童急性T淋巴细胞白血病中的异常表达表明，Mer的抗凋亡作用可能参与某些恶性血液病的发生发展并抵抗药物诱导的凋亡。目前已有多种酪氨酸激酶被报道参与白血病的发生，如由于染色体异位产生的ABL基因就是典型代表，其他还有ARG、FLT3、CFMS、JAK2和CKIT等。目前针对ABL和FLT3的特异性抑制剂已经应用于临床并成为白血病靶向治疗的典范，而Mer在急性T淋巴细胞白血病中的异位表达也提示其可能成为治疗恶性血液病的新药物。
结束语
Mer作为一种新型的酪氨酸激酶在1994年被首次克隆后其功能被日益完善，多篇研究报道其参与炎症、凋亡、血栓、止血等多种生理过程，并且Mer在急性T淋巴白血病细胞以及部分恶性肿瘤白血病细胞株中的异常表达也提示其可能在肿瘤发生发展等重要病理过程中扮演重要的角色，因此针对Gas6/Mer信号转导途径的特异性靶向治疗，可能成为研制相关疾病新一代的药物的线索。
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众所周知,利用单摆可以准确地测定各地的重力加速度。根据,有,只需测出摆长l和周期T,便可求出重力加速度。为了减小测量误差,就必须减小摆长l和周期T这两个测量量的误差;同时需要多次测量重力加速度取平均值。如用传统的实验仪器和方法,不太容易提高其准确度,且计算量特别大,需要实验结束后用计算机器才能完成。若用DIS实验室完成该实验则轻松容易得多,只需准确地测量出摆长,数字采集器可自动测量出单摆的周期,点击一些按钮便可实现计算重力加速度、描绘T-l图像和T2-l图像等功能。
1 器材
计算机、DIS数据采集器、光电门(时间传感器)、细线、金属摆球、铁架台、米尺。
2 装置
用金属球与细线组成单摆,用铁架台悬挂起来。将光电门固定在单摆球平衡位置的下方,使摆球的中央恰好挡住光电门的光束。将传感器与数据采集器相连,数据采集器与计算机相连,装置如图1所示。
3 步骤
1)打开“友高数字化实验室V3.3”,依次点击“物理实验”“单摆”“实验窗口”按钮,进入单摆实验窗口,出现图2所示界面。
2)用米尺测出摆长l,填入“摆长”的大窗口中。
3)让摆球摆动起来,摆角要小一些(最好不超过5°),摆动尽可能处在与光电门的光束垂直的平面内。
4)单击“开始采集”,则表格中逐次显示出连续测量到的周期T值和它们的平均值。
5)单击“停止采集”,然后单击“记录数据”,则当前的一组l、T值(平均值)就会纪录在表格中。
6)多次改变摆长,重复2、3、4、5步骤,公测出不少于6组l、T值(平均值),也会自动记录在表格中(摆长要在0.5～1.5 m范围内取值)。
7)单击“计算T2”,则表格“T2”栏中就会出现一个根据每一个T值计算出的结果。
8)单击“计算g”,则表格“g”栏中就会出现一个根据每一组l、T值计算出的结果,以及这些个g的平均值。
9)单击“保存表格”,将表格保存到“实验报告”中。
10)选定“T-l”图像,单击“画点”,则坐标中出现表格中各组l、T对应的数据点;单击“数据点连线”,则依据这些数据点画出一条曲线。单击“保存图像”,将图像保存到“实验报告”中。
11)选定“T2-l”图像,单击“画点”,则坐标中出现表格中各组l、T2对应的数据点;单击“数据点连线”,则依据这些数据点画出一条直线。单击“保存图像”,将图像保存到“实验报告”中。
12)完成实验报告,单击“存盘”,则会自动形成一个Word文档形式的实验报告。
笔者应用DIS完成“单摆”实验的数据表格及图像分别见表1和图3。从实验结果不难看出,相对误差很小,仅为0.2%,并且将学生从繁琐的计算中解脱出来。
4 思考与探究
