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戊肝疫苗研制
基因工程疫苗是用基因工程方法或分子克隆技术，分离出病原的保护性抗原基因，将其转入原核或真核系统使表达出该病原的保护性抗原，制成疫苗，或者将病原的毒力相关基因删除掉，使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗。包括多肽或亚单位疫苗、颗粒载体疫苗、病毒活载体疫苗、细菌活载体疫苗、基因重配疫苗以及基因缺失疫苗如乙肝疫苗等。
2012年1月11日——一个原本并不特殊的日子，却因一份捷报而注定要被载入史册。科技部在这一天宣布：由厦门大学和养生堂万泰公司联合研制的“重组戊型肝炎疫苗（大肠埃希菌）”已获得国家一类新药证书和生产文号，成为世界上第一个用于预防戊型肝炎的疫苗。
这是50年来，人类在经受了10余次万人以上的戊肝重大疫情后等来的一份捷报。
14年“磨”出世界第一
戊肝疫苗的成功研发，标志着我国在生物制药原始创新领域取得重大突破，它的面世让中国在基因工程病毒疫苗的原始创新上实现了零的突破。11.3万人、30余万针次的研究显示，该疫苗具有良好的安全性和保护性。
2月28日，疫苗研发团队的核心成员——厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心主任夏宁邵教授，在接受科技日报记者采访时表示：“重组戊肝疫苗是迄今唯一使用大肠杆菌表达系统研制的病毒疫苗。它的成功研制扭转了国际医药界中‘原核系统不能用于病毒疫苗研制’的传统认识。”
“传统的疫苗研制方法主要有两种途径。一种是将病毒放在细胞内进行大量培养、灭活，再辅以佐剂，用这种方法制成的疫苗叫灭活疫苗；第二种是将病原体在体外反复传代，去除其致病性，但保留其免疫原性，用这种方法制成的疫苗叫减毒活疫苗。而我们这次是采用的基因工程技术。” 夏宁邵告诉记者，“与传统灭活疫苗和减毒活疫苗比较，基因工程疫苗的研发不依赖于病原体的培养，因此对于大量尚未建立成熟体外培养技术的病原体也能进行疫苗的研制。在生产过程中，基因工程疫苗完全不涉及病原体，消除了由于病原体灭活不彻底或减毒不完全导致的安全性问题。不仅如此，基因工程疫苗的研发还可通过精心设计的纯化过程实现对生产过程中伴随的各类杂质的高效清除和残余成分的高度可控，降低了由于杂质导致的各类接种副反应的风险，提高了疫苗的安全性和耐受性，同时还能提高不同疫苗生产批次间的均一性。”
从1998年开始，时任国家试剂与疫苗中心主任、厦门大学公共卫生学院院长的夏宁邵便带领着他的团队，着手进行戊肝疫苗的研发。与所有的新药研发一样，重组戊肝疫苗的研发并非一路坦途。
历经14年艰苦研发，由厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心和企业的200余名科研人员组成的课题组，在基础研究领域、应用基础研究领域和应用研究领域，取得了保护性抗原识别及结构表征、病毒颗粒组装机制等多项发现成果，并突破了原核表达类病毒颗粒、高效纯化及体外自组装等一系列关键技术障碍，创建出具有多项全球自主知识产权的核心技术体系。
夏宁邵告诉记者，该体系的关键技术已在14个主要国家申请了12项发明专利，对我国发展具有自主知识产权的创新疫苗并高起点地参与国际竞争具有深远意义。基于该体系关键技术，团队研制的另一个疫苗“人瘤病毒16/18型二价疫苗”（宫颈癌疫苗）已经打破了美英技术封锁成为全球第3个、国内第1个获准进行临床试验的宫颈癌疫苗，目前已基本完成Ⅱ期临床试验，初步结果显示该疫苗安全并能刺激人体产生高滴度抗体。
夏宁邵说：“戊肝疫苗是国家工程的成果，也是产学研协同创新的成果。”这份30微克的戊肝疫苗，不仅见证着研发人员的辛劳，同时也记录着我国重大科技专项自主创新的步伐：自2005年起，国家863计划开始对戊肝疫苗项目进行支持，有效地带动了地方、企业投入研发资金近5亿元，其临床研究也被列入“十一五”863计划重大项目中，这为课题组在国内外率先研制成功戊型肝炎疫苗提供了重要支撑。
谈及疫苗研发的前景，夏宁邵显得信心满怀。他的信心来自于国家对这个产业的大力支持：2007年，国家将生物医药确定为“十二五”期间重点发展的战略性新兴产业，尤其是用于应对突发生物事件的疫苗及免疫佐剂等还被列入了公共安全领域生物安全保障方面的优先发展主题。
现阶段疫苗研发应以集成创新为主
作为全国政协委员，中国食品药品检定研究院菌种室主任王国治一直关注着疫苗领域的发展。对夏宁邵团队所取得的成功，他难掩心中的喜悦和激动：“我国能在世界上第一个研发出戊肝疫苗确实非常令人振奋！”
但就国内疫苗研发的整体水平，王国治直言不讳：“我国在疫苗研发领域的基础研究力量还比较薄弱，十个研发有九个都出不了结果。而国家又太过于强调疫苗研发的完全自主知识产权，这与我国目前的疫苗研发水平不相符合。”
“中国的疫苗研发，前期工作几乎都是由大专院校的研究生在做，其可信度和创新性都不够，后期工作也往往跟不上。多数人的研究都以仿制为主，尽管拿了专利，出了蛋白，但真正要作出成果却很难，常常是实验完了，出来一大堆报废产品。”王国治认为，针对我国在疫苗领域现有的研发水平，“在引进国外成熟技术的基础上进行整合创新、集成创新才是这个阶段的重点。”
王国治在考察了发达国家的疫苗生产企业后发现：在疫苗研发上，中国缺的不是硬件，也不是钱，缺的是技术和管理规范。中国对疫苗生产企业的硬件要求比国外更严格，可在软件方面比如管理规范上却放得比较宽。而事实上，疫苗生产过程中，后期主要是规范性管理的问题。
在王国治看来，目前整个疫苗产业还缺少一种系统的协作。他认为，“这与国家在疫苗研发领域和产业规划上缺乏一种整体的顶层设计有关。”
王国治告诉记者，受多种因素制约，国家免疫规划疫苗政府定价总体水平偏低，利润空间较小，以一支重组蛋白类的乙肝疫苗为例，国家定价只有3块多钱每人次，这在一定程度上影响了企业提高产品质量和进行产品升级换代的积极性。而第二类疫苗为市场调节价格产品，流通环节较多，市场价格偏高。
“疫苗产业是关系国计民生的朝阳产业。”对此，王国治建议，国家在制定产业发展策略时，应当充分考虑产业自身的特点和不同的发展背景。在投入上，对与老百姓生命利益息息相关的和研发成本高、失败风险大的一类疫苗，以及共患病的疫苗，国家应当加大扶持力度，而对具有良好发展前景和自主知识产权的二类疫苗，则应当以引导企业生产为主。
加大投入优先发展疫苗产业
对疫苗产业的明天充满同样期待的，还有全球第一支甲流疫苗的生产企业——北京科兴生物制品有限公司的总经理尹卫东。
在甲流肆虐的2009年，尹卫东带领着自己的员工在短短的87天中成功生产出全世界第一支甲流疫苗。在他看来，接种疫苗不但是保护自己的一种措施，同时也是保护他人的一种手段。
“然而目前，人们对接种疫苗的社会认知度却还远远不够。”尹卫东举例说，为了减少老年人群因流感并发症带来的死亡，北京市政府每年都为60岁以上的老人免费接种流感疫苗，然而却只有约50%的老年人进行了自愿接种。
“如果能让老年人接种流感疫苗的百分比从现在的50%提高到80%，老年人因老年病和流感造成的死亡率就会有所降低，这样，实现‘十二五’期间将我国人均寿命提高1岁的目标就会立竿见影。”尹卫东说，“但如果没有疫苗产业的发展就提供不了这样的服务。疫苗产业不仅具有技术高附加值的特性，而且还能节省资源和能源，对整个经济社会的发展具有保驾护航的作用，应该得到优先发展。”
[关键词]基因工程疫苗 核酸疫苗 免疫
[中图分类号]Q789-01 [文献标识码]A [文章编号]1009-5349（2014）11-0081-01
自Edward Jenne医生发明天花疫苗开始，已有几千种疫苗被开发出来，疫苗逐渐成为人类与疾病做斗争的重要武器之一。传统疫苗具有生产的成本高、疫苗中含强毒性致病物质、减毒株突变及部分疾病用传统的疫苗防治收效甚微等缺点。所以，研制更安全、更高效的疫苗十分必要。
DNA重组技术为新一代疫苗――基因工程疫苗的研制提供了全新的方法。基因工程疫苗是指应用DNA重组技术，通过基因组改造，降低病原微生物的致病性，提高免疫原性，进而达到防治传染病的目的。迄今为止，基因工程疫苗是最先进的疫苗，相比传统疫苗而言它有巨大的优势。
一、基因工程疫苗种类
应用基因工程技术开发的已经使用和正在研制的新型疫苗种类主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物可食疫苗等。
（一）基因工程亚单位疫苗
该类疫苗仅包含病原体的抗原，不包含病原体的其他遗传信息。基因工程亚单位疫苗通过表达病毒的主要保护性抗原蛋白获得免疫原性，具有安全、便于规模化生产等优点。该类疫苗的制备步骤如下：①了解编码具有免疫原活性的抗原蛋白对应的基因信息。②从大肠埃希氏菌、酵母、转基因动植物等表达系统中选择最适表达载体。如：酵母表达系统已经大规模生产人用重组肝炎疫苗。基因工程亚单位疫苗可细分为：细菌性疾病、病毒性疾病和激素亚单位疫苗。
1.细菌性疾病亚单位疫苗
分离和鉴定致病菌主要免疫原和毒力因子是研究细菌性亚单位疫苗的基础，目前已研制出与炭疽、大肠杆菌病、牛布鲁氏菌病等对应的亚单位疫苗，均能对相应的疾病产生有效的保护作用。史百芬等发现RSVF蛋白亚单位疫苗（PFP-1）注射接种后接种者无呼吸道疾病加剧作用。
2.病毒性疾病亚单位疫苗
大多数病毒基因组已经被克隆和完全测序，因此病毒性亚单位疫苗的研制相对简单。现在病毒性疾病亚单位疫苗主要有口蹄疫、狂犬病、乙肝疫苗等。中国台湾省科学家研制的禽流感亚单位疫苗效力远比灭活疫苗高。祁贤等应用酵母系统表达生产鸡传染性腔上囊病病毒VP2亚单位疫苗，发现其可完全取代传统灭活疫苗。
3.激素亚单位疫苗
该疫苗是以生长抑制素为免疫原的一类疫苗。杜念兴等将大肠埃希氏菌中表达的生长抑制素基因与HbsAg基因融合，通过Vero细胞表达，结果发现表达产物具有良好的免疫原性。杜念兴等用SS基因疫苗免疫小鼠，发现口服型SS基因疫苗免疫小鼠后可在小肠表达HBsAg/SS融合蛋白，推测该基因疫苗刺激机体表达蛋白后能产生SS抗体。
（二）基因工程活载体疫苗
此类疫苗生产主要有两种方法，一是使非致病性微生物表达某种特定病原物的抗原决定簇基因，进而产生免疫原性，另一种是致病性微生物被修饰或去掉毒性基因，但仍保持免疫原性。活载体疫苗结合了活疫苗和死疫苗的共同优点，在免疫力上具有很大的优势，分复制性和基因突变活载体疫苗。
（三）核酸疫苗
核酸疫苗接种后，抗原合成、增加与病原自然感染十分相似;还具有免疫原性单一;易构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于规模化生产等优点。
二、展望
疫苗开发具有安全性、有效性、价廉性、易推广性等特点。基因工程疫苗具有传统疫苗无可比拟的优点，是疫苗产品开发的主要方向。研制多联或多价疫苗是基因工程疫苗的主要发展方向。
【参考文献】
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关键词：植物疫苗；基因工程；表达系统；安全性
1 植物疫苗的免疫原理
植物疫苗可诱导粘膜免疫反应，小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M 细胞）。粘膜免疫应答就是由M 细胞识别抗原开始的。M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞，巨噬细胞和其它抗原呈递细胞，再将抗原展示给辅T细胞，辅T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体，当疾病因子出现时，记忆辅T细胞刺激胞毒T 细胞攻击受感染的细胞，同时它迅速刺激记忆B 细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体。总的来说，转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA 和IgG 反应。
2 植物疫苗的特点
2.1 安全性高
植物是人类食物来源之一，除个别人群对某些特定的植物过敏外，其安全性高。用动物细胞生产疫苗，可能有动物病毒的污染，对人类存在潜在危害。而植物病毒不会感染人类，比较安全，同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物。
2.2 成本低
植物种植系统简单易行，植物细胞培养条件简单，便于进行遗传操作，可通过大面积栽培获得廉价的疫苗，且不需要技术、设备和种植条件等巨大投资。农作物可以当地生产，还易于储藏和运输，而且经过长期种植，植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化。与植物生物反应器相比，原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大量的人力物力。
2.3 植物具有完整的真核表达系统
具有与动物相同的真核加工修饰系统。可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等。微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工。
2.4 转基因植物中的外源基因可重组
通过植物杂交的方法进行基因重组，进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因，生产出方便高效的多联疫苗。
3 植物基因工程疫苗外源基因的表达系统
3.1 瞬时表达系统
主要采用植物病毒作为载体，而外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒感染植株，从而将外源基因导入植物细胞内，采用这种转化方式，外源基因并不整合至植物基因组中，只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制，以高拷贝的形式游离于植物中，并进行高效的表达，因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋白。采用农杆菌介导的转化，外源基因蛋白的产量一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总量会远大于1%。
3.2 稳定整合系统
3.2.1 土壤农杆菌介导的遗传转化。目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化，其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释。而发根农杆菌，由于对Ri 质粒了解得还不充分，所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育。采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法，即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养，从而达到转化的目的。
3.2.2 外源DNA 直接导入法。主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法，其中最常用的是基因枪法。它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径1μm 左右的金弹或钨弹，再用高压氦气、火药爆炸力、高压放电气体作为动力加速子弹，使它们穿过植物细胞壁和细胞膜，将外源基因带入具有再生能力的植物组织，这样可以在很大程度上缩短再生的时间，从而避免体细胞变异的发生。
4 以植物为载体的免疫技术
4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保护作用
由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用。所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是一个重要的研究课题。目前，避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：①用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体；②用保护性的包被对抗原进行包装。
用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原。但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷，而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、蛋白质体或者表达抗原的转基因植物来实现。许多研究表明，植物材料可潜在地保护所选定的抗原。特别在种子中，植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合物基质环境。其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价，就可以为这些抗原提供保护。在有关转基因马铃薯的研究中，从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A2亚单位融合，抗原的免疫反应显示出对Th1的偏爱性，并可诱导白细胞介素2和干扰素γ，CD4 + 水平也相应增加。Th1的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果。在佐剂的帮助下，亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量。霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒素，它们与抗原共表达，有利于诱导保护性的免疫产生，改变口服免疫低效率递呈。另外，有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征，这给口服免疫可不需佐剂提供了依据，同时也提高了其安全性。
在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用。马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B 亚基和马铃薯中表达的霍乱毒素B 亚基用于小鼠口服免疫，可以保护老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的S2糖蛋白，对乳猪能够起到很好的保护作用。目前，通过植物递送系统来生产B 型肝炎的疫苗也逐渐成熟。
4.2 提高抗原在植物中的表达水平
利用植物进行疫苗开发，首要的问题是，植物能否表达相关的蛋白？目前为止，许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达，这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原。表达水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类，同时，构建的表达系统也影响抗原的表达水平，比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响。一般而言，利用上述策略可以实现抗原高水平表达。然而，很难对表达系统进行比较，因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要，在不同的系统中其表达效果是不一样的。近来，研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量，Mason等利用一个核表达系统，把蛋白定位于内质网滞留信号之后，热不稳定毒素B亚单位在马玲薯块茎中表达量可达总可溶性蛋白质的0.2% ；在谷物种子中的表达量约占总可溶蛋白的4%或12% ，这些都依赖于所用的调节序列。另外，霍乱毒素（B）亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达量约占总可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白，这就需要优化表达系统以提高表达水平。
目前，转基因马玲薯表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲薯大约1mg/g增加到马玲薯大约16mg/g抗原，这样可以大大减少口服剂量。目前许多研究表明，所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构。糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行糖基化，尽管糖基化模式很可能存在着差别。在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和霍乱毒素的B亚单位，均有GM1受体结合活性，B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒，类病毒颗粒的形成，可认为有利于诱导免疫反应。
5 植物基因工程疫苗研究进展
5.1 反转录病毒载体
反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的，许多研究人员认为它同样适于植物基因工程，但目前研究的不多。
5.2 单链RNA植物病毒
单链RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作为mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶病毒(TMV)等。它们作为外源基因载体主要通过以下步骤感染植物：病毒RNA 首先反转录为一条单链cDNA，在DNA聚合酶作用下形成双链DNA，将其克隆入细菌质粒中，将外源基因插入质粒的cDNA中，最后通过体外转录，用带有外源基因的RNA病毒感染植物，将其转入植物细胞。
5.3单链DNA植物病毒载体
在单链DNA 植物病毒载体中，研究最多的是Geminiviruses(简称GeNV) ，又叫做双粒病毒或双联体病毒。它一般含有2个成对并存的病毒颗粒，大小约为18～20nm，遗传物质是单链DNA ,每2个颗粒中包含1～2个、2. 5～3.0 kb的环状DNA分子。该病毒寄主广泛，单子叶植物和双子叶植物均可被感染，但感染部位仅限于植物的维管组织，且其传播媒介主要是昆虫，不能通过机械接种。
5.4 双链DNA植物病毒载体
双链DNA植物病毒载体中最典型的是花椰菜花叶病毒，它的基因组长约8kb，主要感染花椰菜、油菜、拟南芥等，主要寄主是芸苔属植物，目前尚未发现可感染豆科和单子叶植物。
6 植物疫苗的安全性
6.1 对环境的影响
由于在植物疫苗中包含了病原体的DN段，因而花粉和种子的散播造成的基因逃逸可能给人类带来新的病原、毒素、过敏原等，因此对可能引起的基因渐渗现象必须做出充分的安全性评价,并规范植物疫苗的利用和管理，同时寻求技术方法。如可恢复阻塞(RBF)技术，它能使自然界中因渐渗而携带RBF 的杂种或近缘系植物死亡或不育或利用叶绿体转化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，这样就可避免花粉传播而带来的潜在威胁，转基因植物疫苗有着传统疫苗无法比拟的优越性，已经成为一个研究热点了。未来的研究应着眼于生产出作为医药商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。转基因植物疫苗应用最大的限制就是表达量低。现在的研究表明：可以通过叶绿体转化、植物育种和利用食品加工技术来提高表达水平，而且研究还指出，运用携带蛋白和辅助蛋白可以增加抗原被免疫系统识别的能力。这些研究都使我们越来越接近生产出廉价“安全口服的商品植物疫苗”，这样的疫苗将可以帮助人们预防疾病的传播。
6.2对人类和动物的影响
抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用的标记基因。长期食用这类转基因疫苗是否会对人体或动物造成抗生素医疗无效。转基因植物中的新基因会不会传递给人畜肠道的正常微生物，引起菌群和数量的变化或插入并表达，从而危害人畜健康？这些问题目前都无法解答，仍需大量学者继续研究论证。
7 展望
利用植物来表达和递送疫苗技术的发展给免疫研究注入了新的内容。以往的研究中,在植物中表达了包括过滤性病毒、细菌、肠道和非肠道的病原体等各种不同的抗原，并做了相应免疫学研究。但植物疫苗面临的最大问题是抗原蛋白在植物细胞表达量不高，低剂量抗原蛋白往往不能激发足够的免疫反应，这不能仅靠增加植物组织摄取量得以解决，因为低剂量的重复免疫可能会导致机体的免疫耐受，导致机体对此抗原免疫反应保持“低调”，即使以后增加抗原蛋白的剂量也不能改变。另外，机体每天对植物组织的摄取量是一定的，不可能无限增加。因此，未来研究的重点之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表达量。随着生物技术的发展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗递送系统将更具吸引力，并呈现出广阔的应用前景。
参考文献
1 余祖华，王红宁.用植物生物反应器研制基因工程疫苗的进展[J].生
物技术，2004（8）
摘要：为研究鹅细小病毒（GPV）VP2蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果，本试验对GPV延边分离株的vp2基因进行原核表达，将Western-blot试验鉴定为阳性的表达蛋白进行乳化，免疫BALB/c小鼠，应用ELISA方法监测试验动物的体液免疫水平，以此评价该疫苗的免疫效果。结果表明，在三免后2d，重组蛋白佐剂组检测到的血清OD450nm值达0.687，而生理盐水阴性对照组为0.038，两者差异极显著（P
关键词：鹅细小病毒；基因工程亚单位疫苗；免疫试验
关键词：鹅细小病毒；基因工程亚单位疫苗；免疫试验
中图分类号：S835 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0171-1
中图分类号：S835 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0171-1
基金项目：吉林省自然科学基金面上项目（201215230），吉林省牧业管理局项目(吉牧科字第200902号)。
基金项目：吉林省自然科学基金面上项目（201215230），吉林省牧业管理局项目(吉牧科字第200902号)。
细小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，发病率和病死率均较高，临床一旦发病，无有效的治疗办法，严重危害本地区养鹅业的健康发展[1]。目前，国内外用于GP的预防主要以传统疫苗为主，基因工程疫苗尚属探索阶段，尚缺乏GPV基因工程疫苗诱导雏鹅细胞免疫和体液免疫的系统研究资料。在GPV的三个结构基因中，Le Gall-Recule等[2]利用杆状病毒表达系统，证明表达的番鸭细小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究拟对GPV的vp2基因进行原核表达，制备基因工程亚单位疫苗，并进行免疫试验分析，为GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
细小病毒（Goose Parvovirusis，GP）呈世界性分布，发病率和病死率均较高，临床一旦发病，无有效的治疗办法，严重危害本地区养鹅业的健康发展[1]。目前，国内外用于GP的预防主要以传统疫苗为主，基因工程疫苗尚属探索阶段，尚缺乏GPV基因工程疫苗诱导雏鹅细胞免疫和体液免疫的系统研究资料。在GPV的三个结构基因中，Le Gall-Recule等[2]利用杆状病毒表达系统，证明表达的番鸭细小病毒vp2基因具有抗原性和免疫原性。本研究拟对GPV的vp2基因进行原核表达，制备基因工程亚单位疫苗，并进行免疫试验分析，为GPV的vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
1 材料与方法
1 材料与方法
1.1 材料
1.1 材料
BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所；弗氏佐剂购自sigma公司；其他载体与试剂由延边大学预防兽医实验室提供。
BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所；弗氏佐剂购自sigma公司；其他载体与试剂由延边大学预防兽医实验室提供。
1.2 GPV延边株vp2基因工程亚单位疫苗的制备
1.2 GPV延边株vp2基因工程亚单位疫苗的制备
采用常规方法提取GPV延边株的基因组DNA，以特异引物[3]扩增vp2基因片段，构建原核表达载体pET30a-vp2，并在大肠杆菌中诱导表达，将Western-blot鉴定为阳性的蛋白进行亲和层析纯化，纯化后重组蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备GPV的基因工程亚单位疫苗。
采用常规方法提取GPV延边株的基因组DNA，以特异引物[3]扩增vp2基因片段，构建原核表达载体pET30a-vp2，并在大肠杆菌中诱导表达，将Western-blot鉴定为阳性的蛋白进行亲和层析纯化，纯化后重组蛋白与弗氏佐剂混合乳化，制备GPV的基因工程亚单位疫苗。
1.3 vp2基因工程亚单位疫苗的动物免疫试验
1.3 vp2基因工程亚单位疫苗的动物免疫试验
免疫试验共分3组，每组10只BALB/c小鼠，分别为接种VP2重组蛋白组，VP2重组蛋白加佐剂组和生理盐水对照组。在每一次免疫前采血分离血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分别采血分离血清，均存于-20℃备用。
免疫试验共分3组，每组10只BALB/c小鼠，分别为接种VP2重组蛋白组，VP2重组蛋白加佐剂组和生理盐水对照组。在每一次免疫前采血分离血清，第3次免疫后的第2d、4d、6d分别采血分离血清，均存于-20℃备用。
1.4 ELISA监测血清VP2抗体水平
1.4 ELISA监测血清VP2抗体水平
用纯化的VP2重组蛋白为抗原包被反应孔，以小鼠抗GPV阳性血清为一抗，以山羊抗小鼠HRP-IgG为二抗，进行ELISA检测实验小鼠血清中抗体水平，并分析vp2基因工程亚单位疫苗对实验小鼠的体液免疫水平。采用SAS软件对试验数据进行分析。-IgG为二抗，进行ELISA检测实验小鼠血清中抗体水平，并分析vp2基因工程亚单位疫苗对实验小鼠的体液免疫水平。采用SAS软件对试验数据进行分析。
2 结果
2 结果
2.1 GPV vp2基因的原达表达
2.1 GPV vp2基因的原达表达
对pET30a-vp2进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE与Western-blot试验表明，在经考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶上和NC膜上均出现VP2特异性条带（图略），百未诱导的重组菌未出现特异条带。
对pET30a-vp2进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE与Western-blot试验表明，在经考马斯亮兰染色的SDS-PAGE胶上和NC膜上均出现VP2特异性条带（图略），百未诱导的重组菌未出现特异条带。
2.2 GPV重组VP2蛋白的体液免疫水平
2.2 GPV重组VP2蛋白的体液免疫水平
对采集的BALB/c免疫小鼠血清进行ELISA试验检测，每个样品重复检测三次，取平均值计算，详见表1。经统计学分析表明，在三免后第2d，重组蛋白组和重组蛋白佐剂组免疫小鼠血清的OD450nm值均达到最高值，重组蛋白佐剂组与生理盐水阴性对照组间差异极显著（P
对采集的BALB/c免疫小鼠血清进行ELISA试验检测，每个样品重复检测三次，取平均值计算，详见表1。经统计学分析表明，在三免后第2d，重组蛋白组和重组蛋白佐剂组免疫小鼠血清的OD450nm值均达到最高值，重组蛋白佐剂组与生理盐水阴性对照组间差异极显著（P
表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗体消长变化（OD450）
表1 免疫后BALB/c免疫小鼠血清中抗体消长变化（OD450）
组别 一免前 二免前 三免前 三免后2d 三免后4d 三免后6d
组别 一免前 二免前 三免前 三免后2d 三免后4d 三免后6d
重组蛋白组 0.039±
重组蛋白组 0.039±
0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±
0.015 0.312±0.012 0.434±0.022 0.536±0.031 0.480±0.036 0.245±
0.017
0.017
重组蛋白佐剂组 0.033±
重组蛋白佐剂组 0.033±
0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±
0.032 0.498±0.017 0.663±0.028 0.687±0.036 0.569±0.037 0.461±
0.019
0.019
生理盐水组 0.037±
生理盐水组 0.037±
0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±
0.013 0.031±0.015 0.039±0.015 0.038±0.015 0.034±0.015 0.030±
0.015
0.015
3 讨论
3 讨论
本研究以GPV的vp2基因为目的基因，以pET30a为表达载体，在体外高效表达了VP2蛋白，经重组蛋白免疫小鼠试验发现，该重组蛋白具有免疫活性，重组蛋白佐剂组与阴性组间血清抗体水平差异极显著，说明vp2基因可以作为基因工程疫苗的候选基因，而重组蛋白佐剂组与重组蛋白组间血清抗体水平差异显著，提示佐剂对基因工程亚单位苗的免疫效果影响较大。由于本研究只是初步的预试验，未进行攻毒试验和鹅体内试验，这将在下一步试验中予以开展。本研究结果为GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
本研究以GPV的vp2基因为目的基因，以pET30a为表达载体，在体外高效表达了VP2蛋白，经重组蛋白免疫小鼠试验发现，该重组蛋白具有免疫活性，重组蛋白佐剂组与阴性组间血清抗体水平差异极显著，说明vp2基因可以作为基因工程疫苗的候选基因，而重组蛋白佐剂组与重组蛋白组间血清抗体水平差异显著，提示佐剂对基因工程亚单位苗的免疫效果影响较大。由于本研究只是初步的预试验，未进行攻毒试验和鹅体内试验，这将在下一步试验中予以开展。本研究结果为GPV vp2基因工程疫苗的研制奠定基础。
参考文献
参考文献
[1] 方定一.小鹅瘟的介绍[J].中国兽医杂志,1962,8:19-20．
[1] 方定一.小鹅瘟的介绍[J].中国兽医杂志,1962,8:19-20．
[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.
[2] le Gall-Recule, Jestin V,Chagnaud P.Expression of muscovy duck parvovirus capsid proteins (VP2 and VP3) in a baculovirus expression system and demonstration of immunity induced by the recombinant proteins [J].J GenVirol,1996,77(9):2159-2163.
[3] 胡晓静,潘杰,陈进喜,等.2株鹅细小病毒主要结构蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].现代农业科技,2008,(23):262-265.
[3] 胡晓静,潘杰,陈进喜,等.2株鹅细小病毒主要结构蛋白vp2基因的克隆和序列分析[J].现代农业科技,2008,(23):262-265.
作者简介：高旭(1977-)，男，吉林德惠人，博士，副教授，研究方向：动物病毒病分子生物学与免疫学。
2014年2月7日，上海市新发与再现传染病研究所消息称，H7N9禽流感基因疫苗已在上海初步完成研发，目前进入临床试验申报阶段。
研究人员透露，疫苗的有效性和安全性还要进一步通过临床评价来验证。待三期临床完成后，才有可能进入市场，至少需要6年时间，过程中仍存在一定风险。
康恩贝抗抑郁新药获批生产
据国家食药监局网站最新信息，康恩贝3.1类新药草酸艾司西酞普兰片已获批生产。该药是目前全球广为应用的抗抑郁一线药物，2013年国内销售总额超过1亿元。
康恩贝此次精神类新药获批生产，可丰富公司的现有产品线，对未来业绩产生积极作用。
俄罗斯研发出世界首个戒烟疫苗
日前，俄罗斯希姆基纳米实验室的科学家研究出世界第一种戒烟接种疫苗。接种这种疫苗可让烟民永远戒烟， 因为受种者机体会产生一种阻止尼古丁进入大脑的特殊抗体，这种抗体可以让烟民不想吸烟。
目前，这种疫苗已成功通过第一阶段试验，进入临床阶段。
Devices器械
中国电信推出全球首款医疗诊断手机
近日，中国电信与瑞士企业LifeWatch联合推出全球首款医疗诊断手机LifeWatchV，由中国云狐科技提供其移动医疗系统平台。
该产品是一款搭载安卓系统的智能手机，内置7种不同的健康测试。用户只需将拇指放在屏幕感应器上，手机就能开始身体检测，包括心电图、血糖、血氧以及心率等。
可监测血糖值隐形眼镜问世
据谷歌公司官方消息，其目前正在测试一款具有高科技含量的隐形眼镜，可以在佩戴后针对糖尿病患者眼泪中所含的糖分进行监测，随时让患者掌握自己的血糖水平。
这款智能隐形眼镜内置了微型无线芯片和小型葡萄糖传感器，目前处于临床研发过程中，将来有望帮助糖尿病患者真正走出24小时动态监测血糖的痛苦。
可检测肝癌化疗效果的超声系统问世
近日，日本兵库医科大学超声波中心和东芝医疗的研究人员开发出一种可用于快速检测肝癌患者化疗效果的新型超声检测系统。
研究人员介绍，这套新型超声检测系统能够自动追踪病灶位置，检测起来比较简便。其检测方法是，在肝癌患者接受化疗一到两周后，医务人员将造影剂注射到患者血液中，然后采用超声检测系统进行观察。造影剂流入肿瘤用时越长，说明化疗药物的效果越好，肿瘤正在缩小。
Technology技术
中国发现白血病抑癌新基因
中国科学家近期的一项研究发现了一个在急性白血病患者中有较常见突变的抑癌基因，且揭示了其功能异常与多种不同致癌基因之间的协同作用。
研究人员通过对一个混合谱系白血病（MLL）患者及其正常同卵双胞胎的血细胞进行全基因组测序，发现了罕见的功能性MLL-NRIP3致癌基因和H3K36三甲基化的组蛋白甲基转移酶SETD2的遗传突变。此项发现将促进对白血病乃至其他癌症发病机制的认识，有助于临床药物开发。
中国经性感染艾滋病毒者发病更快
北京协和医院感染内科李太生教授等人经过长达6年的研究证实，中国经性传播途径感染艾滋病病毒者，在未经干预情况下往往四五年发病，而非此前欧美研究者认为的平均需8年。
中国经性途径感染艾滋病病毒者中，病毒亚型多为CRF01_AE，该亚型在感染其靶细胞时，须要借助“二传手”，且选用辅助受体CXCR4当“二传手”的比例要显著高于其他亚型。CXCR4可能正是这些艾滋病病毒感染者更快发病的原因。
中国细胞转分化研究获新突破
灭活疫苗与活疫苗
菌苗和疫苗都是由微生物制成的生物制剂，接种于人体后，可诱生特异性免疫。我国习惯上把细菌、螺旋体生物制剂称为菌苗，把病毒、立克次体、衣原体等的生物制剂称为疫苗。
通常所用的疫(菌)苗有两类：一是灭活疫(菌)苗，即把微生物培养物用物理或化学方法杀死而制成。二是减毒活疫(菌)苗，即将有毒力的微生物用人工定向变异的方法使其毒力减弱，或从自然界筛选出来的弱毒或无毒微生物制成活疫(菌)苗。
灭活疫(菌)苗的优点是：在使用上可单独注射，也可几种疫苗按一定比例混合注射，较易保存。保存期限为1年，注射后较安全。缺点是：注射次数多，初种至少需接种2次以上，注射剂量较大。可能出现发热、全身或局部反应，其免疫效果也较差，不持久，常需数月或每年增强免疫一次。
活疫(菌)苗的优点是：其免疫作用较强，一般只需接种1次。接种剂量也较小，接种后反应小或无，接种后的免疫效果可靠而持久，一般可维持1～5年。缺点是：一般只宜单独使用；疫苗不易保存，在普通冰箱内两周即失效。
要特别注意制备活疫苗的病原减毒株的稳定性以及致癌等问题。因此，研制新发病原的疫苗时，由于对该病原的特殊性尚未完全了解，应先从制备灭活疫苗开始。
基因工程疫苗
基因工程是按照人类的愿望，通过基因重新组合得到新的生物品种的一种技术。这种基因工程方法制备生产的疫苗称为基因工程疫苗。以乙肝疫苗为例，就是用基因剪切技术将调控乙肝表面抗原(HB―sAg)的这段基因剪切下来，装到一个表达载体中，表达载体可以把这段基因的功能发挥出来；再把这种表达载体转移到受体细胞内，如大肠杆菌或酵母菌等，最后再通过这些大肠杆菌或酵母菌的快速繁殖，产生出大量我们所需的乙肝疫苗。
过去，乙肝疫苗的来源，是以乙肝病毒携带者的血液为原料，把HB－sAg提取出来制成的，制造过程复杂，价格也较贵。而且这种血源性疫苗也不够安全，它可能混有其他病毒的污染。同时，血液来源也是极有限的，远不能满足全国的需要。基因工程疫苗的问世解决了这一难题。
基因工程在医学上已得到广泛应用，并且应用领域不断被拓宽，取得了令人惊喜的成就。
1 基因工程制药
基因工程制药开创了制药工业的新纪元，解决了过去不能生产或者不能经济生产的药物问题。现在，人类已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人的胰岛素、尿激酶、红细胞生成素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。令人振奋的是，具有高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏儒症等提供了有效的药物。众所周知，医治侏儒症的良药是人生长激素，倘若从人的尸体中获取，治疗一个病人就需要600具尸体的脑下垂体才能获得足够的量；倘若运用基因工程生产，就可从每升基因工程菌液中得到2．4g。人们为此而石破天惊的兴奋!成本如此之低，又如此之高产，其巨大的经济效益和社会效益，由此可见。
2 基因工程抗病毒疫苗
为人类抵御病毒侵袭提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血热病毒疫苗、轮状病毒疫苗等应用于临床，提高了人类对各种病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的问世，使我国新生儿不再遭遇乙型肝炎病毒的侵袭，也降低了人群肝癌的发病率。又如，为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”，就是按照人类的设计，把“生物导弹”发射出去，精确地命中癌细胞，并炸死癌细胞而不伤害健康的细胞。就单克隆细胞而言，单克隆细胞在肿癌的诊断检测、显示定位、监测病变、监测疗效等方面也有重要价值。人类还通过基因工程生产抵御各种病菌、血吸虫、虐原虫等疫苗，提高人体对各种传染病的免疫力。脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世，变革了机体的免疫方式。如今，人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒)疫苗的早日问世。基因工程抗体技术的发展，为克服单克隆抗体生产细胞株在生产过程中的不稳定性，为生产大量高效抗病毒疫苗提供了先进的生产工艺。
3 基因工程治疗疾病
临床实践已经表明，基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如，不治之症——白痴病，用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因，就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传疾病约有4000种，包括单基因缺陷和多基因综合征。运用基因工程技术或者基因打靶的手段，将病毒的基因杀灭，插入校正基因，得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。人类精心设计的基因工程操作，克服了不同个体甚至物种之间由于器官移植所产生的免疫排斥作用，实现人体之间的移植已获成功，成功的实体器官移植有肾、心、肝、胰、肺、肠，也有双器官和多器官的联合移植。而人体与动物之间的器官移植成为现实，临床应用已是指日可待的事了。脱氧核糖核酸化学合成的完善和自动化，脱氧核糖核酸扩增技术的优化，为合成基因“探针”，提高临床诊断的质量，是人类所殷切企盼的。基因治疗有两种途径，一是体细胞的基因治疗，二是生殖细胞的基因治疗。体细胞的基因治疗是将正常的遗传基因导入受精的卵细胞内，让这种遗传物质进入受精卵的基因组内，并随着受精卵分裂，分配到每一个子细胞中去，最终纠正未来个体的遗传缺陷。而生殖细胞的基因治疗是将人类设计的“目的基因”导入患有遗传病病人的生殖细胞内，此法操作技术异常复杂，又涉及伦理，缓行之理充足，故尚无人涉足。
4 基因工程诊病
