血液分析仪溯源校准和质量控制研究

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血液分析仪在临床中有着非常广泛的应用，其检测结果的准确性直接影响临床医生对疾病的临床诊断和治疗。随着仪器技术的进步，血液分析仪变得越来越复杂，全血计数中的定量参数越来越多。近年正从单机检测转向流水线检测，血液分析流水线由血液分析仪、推片染色机、糖化血红蛋白血液仪、蛋白分析仪等检测模块通过轨道连接组成，可使用一管血、一次上机即可得到多个检测的结果。为临床检验人员提供了高效快捷的工作流程，缩短了患者等候检验报告的时间，极大地提高了临床检测效率。同时，检测项目不再局限于血常规检测，新增了HbA1c、CRP和SAA等联合检测功能，这也对检测结果的溯源校准提出了新的需求。迈瑞作为国内最大的血液分析仪制造商，建立了完善的血液分析溯源体系，以保证用户端临床检测结果的准确可靠。血液分析仪的溯源标准化工作主要由ICSH（国际血液学标准化委员会）来推动，目前国际上已经发布了多个参考方法，卫生部已将这些参考方法转化为行业标准指导检测结果标准化的实施。但参考方法运行需要专门的仪器设备，并且速度慢、操作复杂，对人员操作要求高，如果由临床实验室执行，费时费力。国内外的法规都已明确要求制造商提供有溯源性的校准品。本文详细介绍了迈瑞血液分析仪溯源校准和质量控制的实施过程，内部溯源传递始于制造商产品校准品的值，止于所使用的计量上最高参考标准，通过不间断地比较链溯源至目前最高级计量级别的参考级别的参考方法或参考物质[1]。

1最高参考标准

1.1参考方法和参考实验室的建立

目前已建有WBC、RBC、HGB、HCT（MCV）、PLT、RET计数和白细胞分类7个参考方法，参考方法执行过程中对仪器设备、试剂、人员、环境等均有严格要求。通用要求：环境要求18～25℃，人员经过培训，考核合格后才能上岗操作。配制试剂均满足临床实验室I级用水；样本稀释使用硅硼玻璃的A级容量瓶；因血液有一定黏度，所有参考方法加样使用正向置换式移液器，减少黏度的影响，准确度为±0.5%，等等。红细胞和白细胞参考方法：采用ICSH1994年发布的参考方法，使用单通道阻抗原理的半自动粒子计数器，通过梯度稀释血液样本，对结果进行重叠校准。使用的库尔特粒子计数器小孔直径为80～100μm，样本检测体积准确度小于1%，温度对体积的影响每摄氏度小于0.1%；每个样本梯度稀释4个水平，重复配制2次，对8个结果进行直线回归分析，回归直线与Y轴的交点，代表样本无限稀释后，细胞可以一个一个通过小孔被检测，即代表重叠校准的计数值。例如，梯度稀释的重叠校准后，红细胞参考方法结果为4.77，如图1所示。血红蛋白参考方法：采用了CLSIH15-A2发布的参考方法，使用氰化高铁血红蛋白法，在双光束的分光光度计上进行检测。分光光度计狭缝宽度小于等于2nm；配对石英比色杯，内径为（1.000±0.002）cm。样本重复稀释2次，红细胞溶解后，使用0.20～0.25μm的薄膜过滤器进行过滤，排除气泡杂质等影响。检测504nm、540nm、750nm波长下的吸光度。检查氰化高铁血红蛋白溶液纯度1.59≤A540nm/A504nm≤1.63，浊度A750nm≤0.003。计算540nm下血红蛋白的浓度。红细胞压积参考方法：采用了CLSIH7-A3发布的参考方法，使用微量压积离心机离心血样后，在显微镜下使用游标卡尺读取红细胞柱和全血柱的长度进行计算，本方法未修正残留血浆的影响。微量压积离心机半径大于8.0cm，离心5min转子温度不超过45℃。毛细胞符合美国材料实验协会的要求。血小板参考方法：采用了ICSH2001年发布的流式细胞仪法和WHO人工相差显微镜镜检法2个方法互相比对。流式细胞仪法准确性高，但有受抗体质量影响的风险；镜检法准确性差，但稳定不受其他因素影响。使用CD41和CD61两个抗体染料，检测信号不少于5000个，得到红细胞与血小板的比值，再乘以红细胞参考方法的值，间接计算血小板值。网织红细胞和白细胞分类参考方法：分别采用ICSH1998年发布的新亚甲蓝法和CLSIH20-A中的人工镜检法。这2个方法对于血涂片的制备以及镜检人员的能力均有很高要求，所有的镜检人员均经过长期的专业培训，考核合格后方上岗。参考实验室：为确保检测结果准确可靠，参考方法必须由参考实验室执行。迈瑞参考实验室按照ISO17025和ISO15195的要求[2-3]，建立了完善的质量管理体系，并在2009年通过了中国合格评定国家认可委员会（CNAS）认可，保证了实验室参考测量技术能力的保持与提升。

1.2参考物质

可溯源至参考物质的项目包括HbA1c、CRP和SAA等。互换性是参考物质的重要属性。当参考物质用于制造商溯源程序为产品校准品定值时，首先必须验证是否具有互换性[4]。如果产品校准品溯源至没有互换性的参考物质，将导致不同常规程序测量病人样本没有可比性。当验证时发现没有互换性，但已被证明在其他多个测量程序中是有互换性，可修正没有互换性的偏差，并记录使用和验证的详细过程[1]。修正方案参考IFCC互换性工作组推荐的技术指南，包括开发和应用没有互换性偏差的特定修正因子和函数及其不确定度，以及在校准层级中应用修正步骤的位置，实现临床结果到参考物质的可追溯性[5]。

2溯源传递至产品校准品的过程

2.1溯源传递及产品校准品定值

针对每个项目都详细定义溯源层级，并绘制溯源链。为减少测量不确定度，溯源过程应尽量减少中间传递过程，尽可能直接溯源至参考测量程序或参考物质。例如WBC、RBC、HGB、HCT、MCV、PLT等项目均使用参考方法测试新鲜血，直接校准血液分析仪标准测量程序，然后给产品校准品定值。但如果参考测量程序或参考物质有限，可以增加适当的工作校准品。但在没有合适的参考测量程序或参考物质时，会建立内部标准，这种情况通常是新发现的分析物或是参考基准建立困难的情况。但是无论是哪种情况下，都会确保临床结果有适合的溯源校准水平。此外，溯源传递设计的过程中也必须结合产品需要考虑被测量是否相同。例如CRP项目溯源，使用的参考物质ERM474是血清中的CRP质量浓度值，而流水线直接检测的是全血中的CRP质量浓度值，需要通过红细胞压积（HCT）建立血清体积和全血体积的修正因子，报告CRP血清浓度=CRP全血质量浓度/HCT，其测量结果的溯源需合并CRP和HCT两个溯源路径。血液分析仪一体机CRP血清浓度溯源量值图如图2所示。

2.2产品校准品定值

使用参考标准或工作校准品校准制造商标准测量程序，产品校准品通过重复测量，计算平均值得到靶值，并评估测量不确定度。产品校准品的不确定度应包括所有较高计量水平的测量程序和参考标准的不确定度分量总和。

2.3仪器、试剂的质量管理

仪器、试剂的制造质量易受物料质量、产品设计和生产制造水平等多种因素影响。迈瑞在设计开发时既充分考虑这些影响，为检测系统的分析应用和性能设定目标，并在血液分析仪、试剂、校准品和质控品的生产和设计过程中，对检测系统进行初始确认，确认方案参考CLSIH26-A2《自动血液分析的确认、验证和质量保证》和《ICSH血细胞分析仪包括用于微分白细胞和网织红细胞计数的评价指南》[6-7]而制定的。在实际工作中，会为每个检测制定性能目标，通过遵循严格的来料检验、生产过程管理、出厂检验等质量体系管理要求，严格控制生产各个环节，确保出厂的血液分析仪台间、试剂批间一致。血液分析仪使用的质控品、校准品，包括EQA室间质评样本，因人血细胞保存困难，目前基本上都是经过处理的人源细胞、动物源细胞、人工合成物质模拟制备，所以无法避免基质效应的影响。所以在开发设计时会充分评估仪器型号间的差异，如果仪器型号间有明显差异，会按仪器型号提供专有靶值，杜绝型号间差异对临床结果的影响。而且笔者们也与卫生部临检中心等EQA组织持续保持沟通，对有差异的型号分组进行评价，避免对临床仪器的错误评估。

3临床实验室检测结果标准化

检测结果准确是临床诊治的前提条件，理想情况下，同一患者样本无论何时、何地，使用不同的血液分析仪检测，测量结果都应该一致，只可能受生物学变异的影响。为达到此目标，最有效的手段就是减少分析过程中的误差，包括溯源校准、质量控制两大方面，这需要国际标准化组织、制造商和临床实验室的共同努力。校准通过调整仪器排除误差，并通过质量控制保证仪器校准的稳定性。血液分析仪投入使用前必须经过校准，并且每半年或有需要时进行复校准[8]，确保了检测结果的溯源性。迈瑞提供的校准品均满足溯源性要求，并可为用户提供规范的定期校准服务；用户端也可直接使用厂家配套的校准品，按专有的校准界面，自行进行校准过程。同时，迈瑞为临床实验室积极开展质量控制活动提供完善的配套服务，包括室内质控和室间质评，其中参加室间质评费用较高，且受周期的限制，每半年或1年才能评估仪器状态。为突破以上限制，迈瑞配套推出了MRHCP厂家实时在线质量控制平台，利用室内质量控制数据进行实验室间比对。通过该平台，不仅能够方便地获得室内质控统计报告，而且可以实时与全球多家实验室进行对比，评估仪器的准确度、精密度，促进实验室检测能力的提升。除校准和质量控制的影响外，其实际检测结果准确性还受其他分析前、分析中、分析后很多环节的影响。在产品设计开发过程中，已充分考虑各种因素，确保在进样系统、故障报警、维护保养等程序设计时维持仪器的最佳使用状态。如流水线的进样系统可以实现样本自动条码扫描，并按检测项目自动调配上机，避免了样本进样错误。

4测量不确定度

测量结果的计量溯源性通过测量程序和校准物质交替的不间断比较链（比较链可逐级向上减少测量的不确定度），实现计量学上的溯源性。某校准物质由给定校准水平的测量程序定值，应同时评估测量不确定度，此不确定度应包括所有较高计量水平的测量程序和参考标准的不确定度分量总和，即测量不确定度从上至下逐级增大，因此溯源过程应尽量减少中间传递过程。测量不确定度越小，表明实验室测量的质量和能力越高。迈瑞所有检测系统均提供有溯源性、带有测量不确定度的配套产品校准品，用于临床仪器校准，其中把测量不确定度作为靶值的一部分同时提供给用户，包括所有较高计量水平的测量程序和参考标准的不确定度分量总和。由于对溯源过程非常了解，笔者们采用“自下而上”的方法评定的测量不确度，全面分析识别出每一个可能的测量不确定度来源，对重要的不确定度分量进行评估并合成校准品的测量不确定度。为保证临床结果准确性，其测量不确度要求小于临床要求的1/3。

5结束语

制造商在检测结果标准化中扮演着重要的角色，每个制造商均建立有效的溯源传递，将有助于临床检测结果互认。制造商负责提供校准品和正确度控制品，作为体外诊断检测系统的一部分，与仪器、试剂共同使用。迈瑞不仅建立了完善的溯源体系，同时指导用ERM-DA474/IFHCT参考方法CC制造商选定测量程序新鲜血工作校准品血液分析仪标准测量程序血液分析仪标准测量程序产品校准品CRP产品校准品血液分析仪血液分析仪HCT结果CRP全血质量浓度计算CRP血清质量浓度（CRP全血质量浓度浓度/HCT）户端校准和质量控制的应用，在检测结果标准化中履行了自身的职责。

参考文献：

［1］Internationalorganizationforstandardization.ISO17511:2020Invitrodiagnosticmedicaldevices—requirementsforestablishingmetrologicaltraceabilityofvaluesassignedtocalibrators，truenesscontrolmaterials，andhumansamples［S］.Geneva:internationalorganizationforstandardization，2020.

［2］Internationalorganizationforstandardization.ISO/IEC17025:2017Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories［S］.Geneva:internationalorganizationforstandardization，2017.

［3］Internationalorganizationforstandardization.ISO15195:2018Laboratorymedicine—requirementsforthecompetenceofcalibrationlaboratoriesusingreferencemeasurementprocedures［S］.Geneva:internationalorganizationforstandardization，2018.

［4］冯仁丰.互换性依然是问题［J］.检验医学，2013，12（1）：1063-1068.

［5］MILLERWG，BUDDJ，GREENBERGN，etal.Recommendationsforcorrectionofbiascausedbynoncommutabilityofacertifiedreferencematerialusedinthecalibrationhierarchyofanend-usermeasurementprocedure［J］.Clinicalchemistry，2020，66（6）：769-778.

［6］Clinicalandlaboratorystandardsinstitute.CLSIH26-A2validation，verification，andqualityassuranceofautomatedhematologyanalyzers；approvedstandard-secondedition［S］.Wayne，PA:clinicalandlaboratorystandardsinstitute，2010.

［7］BRIGGSC，CULPN，DAVISB，etal.ICSHguidelinesfortheevaluationofbloodcellanalysersincludingthoseusedfordifferentialleucocyteandreticulocytecounting［J］.Internationaljournaloflaboratoryhematology，2014，36：613-627.

作者:杨红玮 单位:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司